| 内容提要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 第1章 序言 | 第11-26页 |
| ·发展燃料乙醇的意义及现状 | 第11-13页 |
| ·我国发展燃料乙醇的战略意义 | 第11-12页 |
| ·国内外燃料乙醇发展现状 | 第12-13页 |
| ·纤维素乙醇与半纤维素乙醇研究 | 第13-18页 |
| ·前景 | 第13-15页 |
| ·关于处理木质素的研究 | 第15-16页 |
| ·关于利用纤维素生产乙醇的研究 | 第16-17页 |
| ·关于利用半纤维素生产乙醇的研究 | 第17-18页 |
| ·木糖异构酶和木酮糖激酶的研究进展 | 第18-21页 |
| ·木糖异构酶(XI,EC 5.3.1.5) | 第18-19页 |
| ·木酮糖激酶(XK,EC2.7.1.17) | 第19-21页 |
| ·巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展 | 第21-23页 |
| ·启动子的研究 | 第21-22页 |
| ·发酵条件的研究 | 第22-23页 |
| ·本研究的目的和意义 | 第23-25页 |
| ·本研究技术路线 | 第25-26页 |
| 第2章 xi和xk基因克隆、表达载体构建和序列分析 | 第26-41页 |
| ·材料与方法 | 第26-34页 |
| ·材料 | 第26-29页 |
| ·菌株和质粒 | 第26页 |
| ·酶类与主要试剂(盒) | 第26页 |
| ·主要仪器设备 | 第26-27页 |
| ·常用培养基、溶液 | 第27-29页 |
| ·方法 | 第29-34页 |
| ·引物设计与合成 | 第29页 |
| ·细菌基因组DNA的提取 | 第29-30页 |
| ·PCR反应 | 第30-31页 |
| ·酶切及回收 | 第31-32页 |
| ·连接反应 | 第32页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第32页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌 | 第32-33页 |
| ·重组转化子的快速筛选 | 第33页 |
| ·重组质粒DNA的提取 | 第33页 |
| ·酶切鉴定 | 第33-34页 |
| ·阳性克隆测序及序列分析 | 第34页 |
| ·结果与分析 | 第34-40页 |
| ·模板的制备 | 第34页 |
| ·PCR扩增木糖异构酶基因(xi)和木酮糖激酶基因(xk) | 第34-35页 |
| ·PCR扩增xi基因及扩增产物的回收 | 第34页 |
| ·PCR扩增xk基因及扩增产物的回收 | 第34-35页 |
| ·构建诱导型表达载体 | 第35-38页 |
| ·表达载体pPIC9K-xi的构建 | 第35-36页 |
| ·pPIC9K-xi的目标基因序列分析 | 第36-37页 |
| ·表达载体pPIC9K-xk的构建 | 第37页 |
| ·pPIC9K-xk的目标基因序列分析 | 第37-38页 |
| ·构建组成型表达载体 | 第38-40页 |
| ·表达载体pGAP9K-xi的构建 | 第38-39页 |
| ·表达载体pGAP9K-xk的构建 | 第39-40页 |
| ·小结 | 第40-41页 |
| 第3章 xi和xk基因在巴斯德毕赤酵母中表达及产物活性分析 | 第41-56页 |
| ·材料与方法 | 第41-49页 |
| ·材料 | 第41-45页 |
| ·菌株和质粒 | 第41页 |
| ·酶类与主要试剂(盒) | 第41页 |
| ·主要仪器设备 | 第41-42页 |
| ·常用培养基、溶液 | 第42-45页 |
| ·方法 | 第45-49页 |
| ·重组质粒线性化 | 第45-46页 |
| ·巴斯德毕赤酵母感受态的制备 | 第46页 |
| ·电击杯清洗流程 | 第46页 |
| ·电转化巴斯德毕赤酵母 | 第46-47页 |
| ·重组酵母染色体DNA的制备 | 第47页 |
| ·重组酵母阳性转化子的筛选与鉴定 | 第47页 |
| ·高拷贝转化子的筛选 | 第47页 |
| ·重组巴斯德毕赤酵母的摇瓶发酵表达 | 第47-48页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第48页 |
| ·酶生物活性检测 | 第48-49页 |
| ·结果与分析 | 第49-55页 |
| ·含xi、xk基因的巴斯德毕赤酵母工程菌构建 | 第49-50页 |
| ·转化巴斯德毕赤酵母 | 第49页 |
| ·PCR法检测阳性转化子 | 第49页 |
| ·在G418平板上筛选高拷贝整合的重组转化子 | 第49-50页 |
| ·摇瓶发酵表达木糖异构酶与木酮糖激酶 | 第50-53页 |
| ·诱导表达木糖异构酶 | 第50-51页 |
| ·诱导表达木酮糖激酶 | 第51页 |
| ·木糖异构酶的组成型表达 | 第51-52页 |
| ·木酮糖激酶的组成型表达 | 第52-53页 |
| ·酶生物活性检测 | 第53-55页 |
| ·微孔板复筛 | 第53-54页 |
| ·木糖发酵试验 | 第54-55页 |
| ·小结 | 第55-56页 |
| 第4章 xi和xk基因在酿酒酵母中表达及产物活性分析 | 第56-62页 |
| ·材料与方法 | 第56-59页 |
| ·材料 | 第56-57页 |
| ·菌株和质粒 | 第56页 |
| ·酶类与主要试剂(盒) | 第56页 |
| ·主要仪器设备 | 第56页 |
| ·常用培养基、溶液 | 第56-57页 |
| ·方法 | 第57-59页 |
| ·重组质粒线性化 | 第57页 |
| ·酿酒酵母感受态的制备 | 第57页 |
| ·电击杯清洗流程 | 第57-58页 |
| ·电转化酿酒酵母 | 第58页 |
| ·高拷贝转化子的筛选 | 第58页 |
| ·重组酿酒酵母的摇瓶发酵表达 | 第58页 |
| ·SDS-PAGE检测 | 第58页 |
| ·酶活性分析 | 第58-59页 |
| ·结果与分析 | 第59-61页 |
| ·含xi、xk基因的酿酒酵母工程菌构建 | 第59页 |
| ·转化酿酒酵母 | 第59页 |
| ·在G418平板上筛选高拷贝整合的重组转化子 | 第59页 |
| ·重组酶在酿酒酵母中组成型表达 | 第59页 |
| ·木糖发酵试验 | 第59-61页 |
| ·小结 | 第61-62页 |
| 第5章 讨论 | 第62-65页 |
| ·表达系统的选择 | 第62-63页 |
| ·整合型表达载体 | 第63页 |
| ·巴斯德毕赤酵母两种启动子表达效果比较 | 第63页 |
| ·存在的问题与展望 | 第63-65页 |
| 第6章 结论 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-74页 |
| 附录一 重组木糖异构酶基因序列分析结果 | 第74-75页 |
| 附录二 重组木酮糖激酶基因序列分析结果 | 第75-77页 |
| 附录三 缩写词(ABBREVIATION) | 第77-78页 |
| 致谢 | 第78页 |
