| 中文摘要 | 第1-16页 |
| Abstract | 第16-20页 |
| 1 引言 | 第20-43页 |
| ·基因沉默 | 第20-25页 |
| ·基因沉默的发现 | 第20-21页 |
| ·转录后基因沉默 | 第21-22页 |
| ·RNA 沉默的分子机制 | 第22-25页 |
| ·基因沉默相关的小分子 RNA | 第25页 |
| ·RNA 沉默抑制子 | 第25-37页 |
| ·RNA 沉默抑制子研究进展 | 第25-29页 |
| ·RNA 沉默抑制子作用机制 | 第29-32页 |
| ·干扰 RNA 沉默的起始 | 第29-30页 |
| ·干扰 siRNA 的积累阻碍 siRNA 整合入 RISC | 第30页 |
| ·干扰 RISC 复合体的形成或者与复合体中的蛋白相互作用 | 第30页 |
| ·干扰沉默信号的短距离或长距离移动 | 第30-32页 |
| ·RNA 沉默抑制子结构功能的研究 | 第32页 |
| ·RNA 沉默抑制子的鉴定方法 | 第32-37页 |
| ·植物体系 | 第32-36页 |
| ·昆虫及动物细胞体系 | 第36-37页 |
| ·RNA 沉默抑制子的应用 | 第37-39页 |
| ·本研究涉及的几种禽类病毒 | 第39-41页 |
| ·火鸡疱疹病毒 | 第39页 |
| ·Ⅰ型马立克氏病毒 | 第39-40页 |
| ·禽流感病毒 | 第40-41页 |
| ·鸡传染性支气管炎病毒 | 第41页 |
| ·本研究的目的意义和主要内容 | 第41-43页 |
| 2 材料与方法 | 第43-62页 |
| ·材料 | 第43-44页 |
| ·毒源 | 第43页 |
| ·植物材料 | 第43页 |
| ·菌株和质粒 | 第43页 |
| ·PCR 引物（由济南博尚生物技术有限公司合成） | 第43-44页 |
| ·方法 | 第44-62页 |
| ·植物材料管理 | 第44-45页 |
| ·禽类病毒的提纯及病毒 RNA、DNA 的提取 | 第45-47页 |
| ·鸡胚接种与病毒的增殖 | 第45页 |
| ·鸡胚成纤维细胞的制备及病毒的接种 | 第45-46页 |
| ·病毒 RNA 的提取 | 第46页 |
| ·病毒 DNA 的提取 | 第46-47页 |
| ·cDNA 的合成 | 第47页 |
| ·目的基因的克隆及载体的构建 | 第47-52页 |
| ·PCR 扩增 | 第47-48页 |
| ·DNA 片段的回收（试剂盒法） | 第48页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备 | 第48-49页 |
| ·目的片段与克隆载体的连接 | 第49页 |
| ·质粒 DNA 向大肠杆菌中转化（热激法） | 第49页 |
| ·转化菌落 PCR 鉴定 | 第49页 |
| ·测序鉴定 | 第49-50页 |
| ·质粒 DNA 的微量提取 | 第50页 |
| ·目的片段和质粒 DNA 的酶切 | 第50-51页 |
| ·目的片段与质粒 DNA 的连接 | 第51页 |
| ·农杆菌感受态细胞的制备 | 第51页 |
| ·质粒 DNA 向农杆菌中转化（冻融法） | 第51-52页 |
| ·瞬时表达系统及沉默现象观察 | 第52-53页 |
| ·农杆菌介导的瞬时表达系统 | 第52页 |
| ·长波紫外灯观察 | 第52页 |
| ·激光共聚焦显微镜观察 | 第52-53页 |
| ·定点突变 | 第53-54页 |
| ·CTAB 法提取植物基因组总 DNA（小量法） | 第54页 |
| ·Western blot 检测 | 第54-57页 |
| ·烟草叶片总蛋白质的提取 | 第54-55页 |
| ·SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第55-56页 |
| ·半干法蛋白转移 | 第56页 |
| ·免疫检测 | 第56页 |
| ·显色法检测蛋白质 | 第56-57页 |
| ·总 RNA 的 Northern blot 检测 | 第57-59页 |
| ·热酚提取植物总 RNA | 第57页 |
| ·甲醛变性凝胶电泳 | 第57-58页 |
| ·总 RNA 的转膜 | 第58页 |
| ·总 RNA 的杂交 | 第58-59页 |
| ·小分子 RNA 的 Northern blot 检测 | 第59-62页 |
| ·热酚提取植物小分子 RNA | 第59-60页 |
| ·尿素/聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第60-61页 |
| ·小分子 RNA 的转膜 | 第61页 |
| ·小分子 RNA 的杂交 | 第61-62页 |
| 3 结果与分析 | 第62-102页 |
| ·禽类病毒 RNA 沉默抑制子的筛选鉴定 | 第62-66页 |
| ·候选 RNA 沉默抑制蛋白 | 第62页 |
| ·候选 RNA 沉默抑制蛋白基因的载体构建 | 第62-65页 |
| ·目的基因的克隆 | 第62-63页 |
| ·克隆载体的构建与鉴定 | 第63-64页 |
| ·植物表达载体的构建与鉴定 | 第64-65页 |
| ·候选 RNA 沉默抑制蛋白瞬时侵染分析 | 第65-66页 |
| ·GFP 反向重复序列载体的构建 | 第66-67页 |
| ·HVT063 突变体的获得及载体构建 | 第67-69页 |
| ·NS1 突变体的获得及载体构建 | 第69-70页 |
| ·表达 HVT063 和 NS1 的 PVX 病毒载体构建 | 第70-71页 |
| ·HVT063 沉默抑制功能分析 | 第71-88页 |
| ·HVT063 抑制局部性 RNA 沉默 | 第71-74页 |
| ·HVT063 抑制单链 RNA 引发的局部 RNA 沉默 | 第71-72页 |
| ·HVT063 抑制双链 RNA 引发的局部 RNA 沉默 | 第72-74页 |
| ·利用 PVX 病毒载体验证 HVT063 的 RNA 沉默抑制功能 | 第74-75页 |
| ·HVT063 逆反已建立的局部 RNA 沉默 | 第75-77页 |
| ·HVT063 抑制系统性 RNA 沉默 | 第77-80页 |
| ·HVT063 抑制单链 RNA 引发的系统性 RNA 沉默 | 第77-78页 |
| ·HVT063 抑制双链 RNA 引发的系统性 RNA 沉默 | 第78-80页 |
| ·HVT063 的沉默抑制活性与细胞致死能力具有剂量依赖性 | 第80-85页 |
| ·HVT063 突变分析 | 第85-88页 |
| ·NS1 沉默抑制功能分析 | 第88-102页 |
| ·NS1 抑制局部性 RNA 沉默 | 第88-91页 |
| ·NS1 抑制单链 RNA 引发的局部 RNA 沉默 | 第88-90页 |
| ·NS1 抑制双链 RNA 引发的局部 RNA 沉默 | 第90-91页 |
| ·NS1 抑制系统性 RNA 沉默 | 第91-94页 |
| ·NS1 抑制单链 RNA 引发的系统性 RNA 沉默 | 第91-93页 |
| ·NS1 抑制双链 RNA 引发的系统性 RNA 沉默 | 第93-94页 |
| ·NS1 与 p19 沉默抑制能力的比较 | 第94-96页 |
| ·NS1 突变分析 | 第96-102页 |
| ·NS1 各突变体抑制单链 RNA 引发局部 RNA 沉默的能力比较 | 第96-99页 |
| ·NS1 各突变体抑制双链 RNA 引发局部 RNA 沉默的能力比较 | 第99-102页 |
| 4 讨论 | 第102-108页 |
| ·HVT063 和禽流感 NS1 为新鉴定的 RNA 沉默抑制子 | 第102-103页 |
| ·HVT063 沉默抑制特点及可能的作用方式 | 第103-106页 |
| ·HVT063 的局部 RNA 沉默抑制活性 | 第103页 |
| ·HVT063 在 PVX 病毒表达载体中的 RNA 沉默抑制活性 | 第103-104页 |
| ·HVT063 的 RNA 沉默抑制活性、细胞致死能力与其剂量之间的关系 | 第104页 |
| ·HVT063 的系统 RNA 沉默抑制活性 | 第104-105页 |
| ·HVT063 的 RNA 沉默抑制功能区域 | 第105-106页 |
| ·NS1 沉默抑制特点及可能的作用方式 | 第106-108页 |
| ·NS1 的局部 RNA 沉默抑制活性 | 第106页 |
| ·NS1 的系统 RNA 沉默抑制活性 | 第106-107页 |
| ·NS1 的 RNA 沉默抑制功能区域 | 第107-108页 |
| 5 结论 | 第108-110页 |
| 参考文献 | 第110-127页 |
| 致谢 | 第127-128页 |
| 攻读学位期间发表论文情况 | 第128页 |
