| 致谢 | 第1-10页 |
| 摘要 | 第10-12页 |
| Abstract | 第12-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-26页 |
| 前言 | 第14页 |
| ·L-肉碱的结构与生理功能 | 第14-16页 |
| ·L-肉碱的应用 | 第16-20页 |
| ·L-肉碱在医药领域的应用 | 第16-18页 |
| ·L-肉碱在心血管系统疾病中的应用 | 第16-17页 |
| ·L-肉碱与男科疾病 | 第17页 |
| ·乙酰肉碱在神经系统疾病中的应用 | 第17页 |
| ·L-肉碱在血液透析及肾功能紊乱患者中的应用 | 第17-18页 |
| ·L-肉碱与其他疾病 | 第18页 |
| ·L-肉碱在食品行业的应用 | 第18-19页 |
| ·L-肉碱作为营养强化剂 | 第18-19页 |
| ·L-肉碱作为运动员营养补充剂 | 第19页 |
| ·L-肉碱在减肥食品中应用 | 第19页 |
| ·L-肉碱作为饲料添加剂 | 第19-20页 |
| ·L-肉碱的合成与代谢 | 第20-22页 |
| ·L-肉碱在高等动物体内的合成与代谢 | 第20页 |
| ·L-肉碱在微生物中的合成 | 第20-21页 |
| ·L-肉碱在微生物中的降解 | 第21-22页 |
| ·L-肉碱代谢相关酶的研究现状 | 第22-24页 |
| ·L-肉碱合成相关酶的研究 | 第22-23页 |
| ·L-肉碱降解相关酶的研究 | 第23-24页 |
| ·L-肉碱的生产 | 第24页 |
| ·本研究的目的及内容 | 第24-26页 |
| 第二章 产L-肉碱菌株的分离及鉴定 | 第26-40页 |
| ·材料 | 第26-27页 |
| ·菌株的分离源 | 第26页 |
| ·试验仪器 | 第26页 |
| ·培养基 | 第26-27页 |
| ·试验方法 | 第27-33页 |
| ·季铵盐法的建立 | 第27-28页 |
| ·最佳测试pH及最佳吸光值测定波长的确定 | 第27-28页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第28页 |
| ·气相色谱法(内标法)精确测定培养液中γ-丁基甜菜碱浓度 | 第28页 |
| ·肉碱脱氢酶活性的测定 | 第28-29页 |
| ·粗酶液的制备 | 第28-29页 |
| ·L-肉碱脱氢酶活性测定 | 第29页 |
| ·D-肉碱脱氢酶活性测定 | 第29页 |
| ·菌种筛选 | 第29-30页 |
| ·菌种初筛 | 第29-30页 |
| ·菌种复筛 | 第30页 |
| ·分离菌株L-1的鉴定 | 第30-33页 |
| ·细菌的形态观察 | 第30页 |
| ·生理生化鉴定 | 第30-31页 |
| ·16S rDNA序列测定 | 第31-32页 |
| ·基于16S rDNA序列的系统发育分析 | 第32-33页 |
| ·结果与分析 | 第33-39页 |
| ·季铵盐法的建立 | 第33-34页 |
| ·最佳测试pH及最佳吸光值测定波长的确定 | 第33-34页 |
| ·标准曲线的绘制 | 第34页 |
| ·产L-肉碱菌株的筛选 | 第34-35页 |
| ·菌株L-1的鉴定 | 第35-39页 |
| ·菌株L-1的形态学鉴定 | 第35页 |
| ·菌株L-1生理生化特征 | 第35-38页 |
| ·菌株L-1的16S rDNA序列测定及系统发育分析 | 第38-39页 |
| ·结论 | 第39-40页 |
| 第三章 菌株L-1的γ-丁基甜菜碱羟化酶基因(bbh)的克隆与表达 | 第40-54页 |
| ·材料 | 第40-42页 |
| ·菌种和载体 | 第40页 |
| ·主要试剂 | 第40页 |
| ·常用培养基和缓冲液 | 第40-41页 |
| ·常用仪器 | 第41-42页 |
| ·方法 | 第42-47页 |
| ·DNA操作 | 第42页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第42页 |
| ·菌株L-1的bbh基因扩增及测序 | 第42-43页 |
| ·多重比对及系统发育分析 | 第43-44页 |
| ·三维结构预测 | 第44页 |
| ·限制性内切酶双酶切 | 第44页 |
| ·连接及转化 | 第44-45页 |
| ·转化子的挑选及鉴定 | 第45页 |
| ·9 E.coli BL21(DE3)的转化及诱导表达 | 第45-46页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第46-47页 |
| ·结果和讨论 | 第47-53页 |
| ·菌株L-1的bbh基因的扩增 | 第47-49页 |
| ·多重比对及系统发育分析 | 第49-50页 |
| ·BBH三维结构预测 | 第50-51页 |
| ·重组质粒pET-15b-BBH的构建及融合蛋白的诱导表达 | 第51-53页 |
| ·结论 | 第53-54页 |
| 第四章 重组γ-丁基甜菜碱羟化酶的纯化及性质研究 | 第54-64页 |
| ·材料 | 第54-55页 |
| ·材料和试剂 | 第54页 |
| ·培养基及缓冲液 | 第54-55页 |
| ·主要仪器 | 第55页 |
| ·方法 | 第55-58页 |
| ·菌体大量培养 | 第55页 |
| ·重组酶的纯化 | 第55-56页 |
| ·重组蛋白酶性质研究 | 第56-57页 |
| ·重组蛋白分子量的确定 | 第56页 |
| ·γ-丁基甜菜碱羟化酶活性测定 | 第56-57页 |
| ·最适反应温度及热稳定性 | 第57页 |
| ·最适反应pH及pH稳定性 | 第57页 |
| ·重组大肠杆菌静止细胞与纯化的BBH分别转化生产L-肉碱 | 第57-58页 |
| ·结果与分析 | 第58-63页 |
| ·重组酶的纯化及分子量测定 | 第58-60页 |
| ·最适反应温度及热稳定性 | 第60-61页 |
| ·最适反应pH及pH稳定性 | 第61-62页 |
| ·重组大肠杆菌静止细胞与纯化的BBH分别转化生产L-肉碱 | 第62-63页 |
| ·结论 | 第63-64页 |
| 第五章 菌株L-1的L-肉碱脱氢酶基因cdh的敲除及γ-丁基甜菜碱代谢途径研究 | 第64-80页 |
| ·材料 | 第64-66页 |
| ·菌种和质粒 | 第64页 |
| ·主要试剂 | 第64-65页 |
| ·常用培养基和缓冲液 | 第65-66页 |
| ·主要仪器 | 第66页 |
| ·方法 | 第66-73页 |
| ·DNA操作 | 第66页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第66-67页 |
| ·菌株L-1的cdh基因扩增及测序 | 第67-68页 |
| ·菌株L-1的L-肉碱脱氢酶的重组表达 | 第68-69页 |
| ·重组L-肉碱脱氢酶的酶活测试及SDS-PAGE电泳分析 | 第69页 |
| ·敲除用载体pK18mobsacB-△cdh的构建 | 第69-71页 |
| ·菌株L-1与含质粒pK18mobsacB-△cdh的WM3064进行接合 | 第71-72页 |
| ·突变体L-1-△cdh的筛选 | 第72页 |
| ·菌株L-1与L-1-△cdh肉碱积累量的比较 | 第72页 |
| ·HPLC-M5分析 | 第72-73页 |
| ·结果和分析 | 第73-79页 |
| ·菌株L-1的cdh基因扩增及测序 | 第73-75页 |
| ·菌株L-1的L-肉碱脱氢酶的重组表达 | 第75-76页 |
| ·菌株L-1的L-肉碱脱氢酶基因的敲除 | 第76-78页 |
| ·菌株L-1与L-1-△cdh肉碱积累量的比较 | 第78-79页 |
| ·结论 | 第79-80页 |
| 第六章 结论与展望 | 第80-83页 |
| ·研究结论 | 第80-81页 |
| ·转化γ-丁基甜菜碱生成L-肉碱的菌株的分离和鉴定 | 第80页 |
| ·γ-丁基甜菜碱羟化酶基因(bbh)的克隆与表达 | 第80页 |
| ·重组γ-丁基甜菜碱羟化酶的纯化及性质研究 | 第80-81页 |
| ·菌株L-1的L-肉碱脱氢酶基因cdh的敲除 | 第81页 |
| ·创新点 | 第81-82页 |
| ·展望 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-89页 |
