豆豉溶栓酶基因的克隆表达及其体外进化研究
| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 英文缩写表 | 第11-12页 |
| 1. 前言 | 第12-24页 |
| ·溶栓酶的研究背景 | 第12-14页 |
| ·血栓形成及机制 | 第12-13页 |
| ·血栓对机体的影响 | 第13页 |
| ·血栓治疗进展 | 第13-14页 |
| ·豆豉溶栓酶的研究现状 | 第14-18页 |
| ·溶栓酶的产生菌种 | 第15-16页 |
| ·溶栓酶的分离纯化 | 第16页 |
| ·溶栓酶的生化特性 | 第16-17页 |
| ·溶栓酶的生物学功能 | 第17-18页 |
| ·溶栓酶的分子生物学研究 | 第18页 |
| ·定向进化 | 第18-22页 |
| ·定向进化的概念 | 第18-19页 |
| ·定向进化的原理 | 第19-20页 |
| ·定向进化的策略 | 第20-21页 |
| ·筛选 | 第21-22页 |
| ·本实验的研究意义及应用前景 | 第22-24页 |
| 2. 豆豉溶栓酶基因的克隆表达 | 第24-38页 |
| ·试验材料 | 第24-25页 |
| ·菌株 | 第24-25页 |
| ·培养基 | 第25页 |
| ·试剂与仪器 | 第25页 |
| ·实验方法 | 第25-31页 |
| ·酶活测定方法 | 第25-26页 |
| ·枯草芽孢杆菌LD-8547 基因组的提取 | 第26页 |
| ·目的基因的PCR | 第26-27页 |
| ·质粒小量提取 | 第27-28页 |
| ·表达载体的构建 | 第28-29页 |
| ·大肠杆菌感受态细胞的制备（CaC12 法） | 第29页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌感受态细胞 | 第29-30页 |
| ·重组质粒验证 | 第30页 |
| ·转化子的诱导 | 第30页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第30-31页 |
| ·SDS-PAGE 及酶活测定 | 第31页 |
| ·实验结果 | 第31-35页 |
| ·表达载体pET28a-fe 的构建 | 第31-34页 |
| ·蛋白的表达及酶活分析 | 第34-35页 |
| ·小结与讨论 | 第35-38页 |
| 3. 豆豉溶栓酶基因的体外进化 | 第38-56页 |
| ·试验材料 | 第38-39页 |
| ·菌株 | 第38-39页 |
| ·培养基 | 第39页 |
| ·试剂与仪器 | 第39页 |
| ·实验方法 | 第39-47页 |
| ·溶栓酶活性测定及蛋白含量测定 | 第39-41页 |
| ·质粒的提取 | 第41页 |
| ·目的基因的PCR | 第41-42页 |
| ·易错PCR | 第42页 |
| ·琼脂糖凝胶中DNA 片段的回收纯化 | 第42-43页 |
| ·交错延伸 | 第43-44页 |
| ·重组质粒的构建 | 第44-45页 |
| ·转化 | 第45页 |
| ·重组子的筛选及初步鉴定 | 第45页 |
| ·动力学分析 | 第45-47页 |
| ·实验结果 | 第47-53页 |
| ·目的基因的易错PCR | 第47页 |
| ·目的基因的交错延伸 | 第47-48页 |
| ·突变酶的初步筛选 | 第48页 |
| ·突变酶的进一步筛选 | 第48-49页 |
| ·突变酶的动力学分析 | 第49-53页 |
| ·讨论 | 第53-56页 |
| ·米氏常数的分析 | 第54页 |
| ·反应常数的分析 | 第54页 |
| ·催化效率的分析 | 第54-56页 |
| 参考文献 | 第56-60页 |
| 附录 | 第60-67页 |
| 致谢 | 第67页 |
