| 中文部分 | 第1-121页 |
| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-11页 |
| 缩略语 | 第11-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-26页 |
| ·真核膜蛋白表达现状综述 | 第13-23页 |
| ·表达体系 | 第15-18页 |
| ·表达条件 | 第18-21页 |
| ·蛋白纯化策略 | 第21-22页 |
| ·真核内在膜蛋白重组的综合考虑 | 第22-23页 |
| ·ESP–S. pombe 粟酒裂殖酵母表达系统简介 | 第23-26页 |
| 2 基因克隆和载体构建 | 第26-34页 |
| ·材料和试剂 | 第26页 |
| ·主要仪器和设备 | 第26-27页 |
| ·方法 | 第27-32页 |
| ·GLUT1、 GLUT2 和GLUT3 全长基因的克隆 | 第27-28页 |
| ·pESP-GLUTs 表达载体的构建 | 第28-32页 |
| ·结果与讨论 | 第32-34页 |
| ·GLUT1、 GLUT2 和 GLUT3 全长基因的克隆 | 第32页 |
| ·pESP-GLUTs 表达载体的构建及DNA 测序 | 第32-34页 |
| 3 葡萄糖转运载体 GLUT1、GLUT2 和GLUT3 在S.pombe 中的表达及宿主相关基因表达情况的实验研究 | 第34-68页 |
| ·材料和试剂 | 第35-36页 |
| ·主要仪器和设备 | 第36页 |
| ·方法 | 第36-46页 |
| ·粟酒裂殖酵母的转化 | 第36-37页 |
| ·融合蛋白诱导表达条件的优化(以GST-GLUT1 为例) | 第37-41页 |
| ·GLUT1 表达的半定量RT-PCR 分析 | 第41-43页 |
| ·不同诱导条件下宿主相关基因表达的半定量分析 | 第43页 |
| ·融合蛋白GST-GLUT1 的亲和层析纯化 | 第43-44页 |
| ·融合蛋白GST-GLUT2、GST-GLUT3 的表达纯化 | 第44页 |
| ·蛋白免疫印迹分析 | 第44-45页 |
| ·纯化蛋白的定量 | 第45-46页 |
| ·结果 | 第46-63页 |
| ·酵母转化鉴定 | 第46页 |
| ·融合蛋白诱导表达条件的优化(以GST-GLUT1 为例) | 第46-56页 |
| ·GLUT1 表达的半定量RT-PCR 分析 | 第56-57页 |
| ·不同诱导条件下宿主相关基因表达的半定量分析 | 第57-59页 |
| ·融合蛋白GST-GLUT1 的亲和层析纯化 | 第59-60页 |
| ·融合蛋白GST-GLUT2、GST-GLUT3 的表达纯化 | 第60-61页 |
| ·蛋白免疫印迹分析 | 第61页 |
| ·纯化的融合蛋白定量 | 第61-63页 |
| ·讨论 | 第63-68页 |
| 4 GLUT1 与GAPDH 体外相互作用的鉴定 | 第68-73页 |
| ·材料和试剂 | 第68页 |
| ·主要仪器和设备 | 第68-69页 |
| ·方法 | 第69页 |
| ·结果 | 第69-71页 |
| ·GLUT1 和GAPDH 的相互作用的SDS-PAGE 分析 | 第69-70页 |
| ·GLUT1 和GAPDH 的相互作用的Western-blotting 分析 | 第70-71页 |
| ·讨论 | 第71-73页 |
| 5 GLUT1 小鼠多克隆抗体的生产 | 第73-80页 |
| ·材料和试剂 | 第73页 |
| ·主要仪器和设备 | 第73-74页 |
| ·方法 | 第74-75页 |
| ·融合蛋白的酶切 | 第74页 |
| ·小鼠免疫 | 第74页 |
| ·ELISA 法检测抗血清效价 | 第74-75页 |
| ·蛋白A/G 柱纯化抗血清 | 第75页 |
| ·纯化抗体的SDS-PAGE 和Western-blotting 分析 | 第75页 |
| ·结果 | 第75-78页 |
| ·融合蛋白的酶切 | 第75-76页 |
| ·ELISA 法检测抗血清效价 | 第76-77页 |
| ·纯化抗体的SDS-PAGE 分析 | 第77页 |
| ·纯化抗体的 Western-Blotting 分析 | 第77-78页 |
| ·讨论 | 第78-80页 |
| 6 葡萄糖转运蛋白(GLUT)家族的进化分析及GLUT1 结构信息分析 | 第80-99页 |
| ·绪论 | 第80-84页 |
| ·材料和方法 | 第84-85页 |
| ·数据收集 | 第84页 |
| ·多重序列比对，进化树构建和Ka/Ks 分析 | 第84-85页 |
| ·GLUT1 蛋白结构保守性的分析 | 第85页 |
| ·结果 | 第85-97页 |
| ·GLUT 家族成员在物种中的分布 | 第85页 |
| ·GLUT 家族系统发育分析 | 第85-89页 |
| ·Ka/Ks 分析 | 第89-92页 |
| ·GLUT1 (SLC2A1)进化分析 | 第92-95页 |
| ·GLUT1 结构上的保守序列分析 | 第95-97页 |
| ·讨论 | 第97-99页 |
| 7 主要的实验结果和结论 | 第99-100页 |
| 致谢 | 第100-101页 |
| 参考文献 | 第101-113页 |
| 附录 | 第113-121页 |
| A 各种溶液、缓冲液及培养基配方 | 第113-120页 |
| B 在读期间已发表及待发表的文章 | 第120页 |
| C 在读期间负责和参研的课题 | 第120-121页 |
| 英文部分 | 第121-255页 |
| 摘要 | 第123-125页 |
| ABSTRACT | 第125-128页 |
| ABBREVIATIONS | 第128-133页 |
| 中文概要 | 第133-143页 |
| CHAPTER ONE INTRODUCTION | 第143-159页 |
| ·Overview of Eukaryotic Membrane Protein Expression | 第143-155页 |
| ·Expression systems | 第145-150页 |
| ·Expression conditions | 第150-153页 |
| ·Protein purification strategies | 第153-155页 |
| ·Integrated considerations recombination of eukaryotic IMPs | 第155页 |
| ·Introduction of pESP2–S. pombe expression system | 第155-159页 |
| CHAPTER TWO GENE CLONING AND VECTOR CONSTRUCTION | 第159-167页 |
| ·Materials and Reagents | 第159页 |
| ·Equipments | 第159-160页 |
| ·Methods | 第160-165页 |
| ·Cloning the full length gene fragments of GLUT1, GLUT2 and GLUT3 | 第160-161页 |
| ·Construction of pESP-GLUT plasmids | 第161-165页 |
| ·Results and Discussion | 第165-167页 |
| ·Cloning the full length gene fragments of GLUT1, GLUT2 and GLUT3 | 第165-166页 |
| ·Construction of pESP-GLUT plasmids and DNA sequencing | 第166-167页 |
| CHAPTER THREE THE HETEROLOGOUS EXPRESSION AND PURIFICATION OF HUMAN GLUT1, GLUT2 AND GLUT3 IN S. pombe AND THE RELATED ENCODING GENES EXPRESSION OF THE HOST | 第167-200页 |
| ·Materials and Reagents | 第167-168页 |
| ·Equipments | 第168-169页 |
| ·Methods | 第169-178页 |
| ·Fission yeast (SP-Q01) transformation | 第169-170页 |
| ·Optimization of fusion protein expression (take GST-GLUT1 as the example) | 第170-174页 |
| ·Semi-quantitative RT-PCR analysis of GLUT1 expression | 第174-175页 |
| ·The related encodeing genes expression of the host under different growth conditions | 第175-176页 |
| ·GST-affinity chromatography purification of GST-GLUT1 | 第176-177页 |
| ·Expression and purification of GST-GLUT2, GST-GLUT3 | 第177页 |
| ·Western-blotting analysis | 第177-178页 |
| ·Calculation of protein concentrations and yields | 第178页 |
| ·Results | 第178-194页 |
| ·Verification of Fission yeast transformation | 第178-179页 |
| ·Optimization of fusion protein expression (take GST-GLUT1 as the example) | 第179-187页 |
| ·Semi-quantitative RT-PCR analysis of GLUT1 expression | 第187-189页 |
| ·The related encoding genes expression of the host under different growth conditions | 第189-191页 |
| ·GST-affinity chromatography purification of GST-GLUT1 | 第191页 |
| ·Expression and purification of GST-GLUT2, GST-GLUT3 | 第191-192页 |
| ·Western-blotting analysis of GST-GLUTs | 第192-193页 |
| ·Calculation of protein concentrations and yields | 第193-194页 |
| ·Discussion | 第194-200页 |
| CHAPTER FOUR VERIFICATION OF THE INTERACTIONS BETWEEN GLUT1 AND GAPDH | 第200-207页 |
| ·Materials and Reagents | 第200页 |
| ·Equipments | 第200-201页 |
| ·Methods | 第201-202页 |
| ·Results | 第202-204页 |
| ·Detection of the interactions between GLUT1 and GAPDH by SDS-PAGE | 第202页 |
| ·Western-blotting analysis | 第202-204页 |
| ·Discussion | 第204-207页 |
| CHAPTER FIVE MOUSE POLYCLONAL ANTIBODY PRODUCTION OF GLUT1 | 第207-214页 |
| ·Materials and Reagents | 第207页 |
| ·Methods | 第207-209页 |
| ·Protein preparation | 第207-208页 |
| ·Mice immunization | 第208页 |
| ·Screening of Polyclonal Antibody using ELISA Assay | 第208页 |
| ·Purification of the antiserum using Protein A/G column | 第208-209页 |
| ·SDS-PAGE and Western-blotting analysis | 第209页 |
| ·Results and Discussion | 第209-214页 |
| ·Protein digestion | 第209-210页 |
| ·Titre of Polyclonal Antibody using ELISA Assay | 第210-211页 |
| ·The purified polyclonal antibody analysis by SDS-PAGE | 第211页 |
| ·Western-blotting analysis | 第211-214页 |
| CHAPTER SIX EVOLUTION OF GLUT FAMILY AND A COMPARATIVE STRUCTURAL BIOINFORMATICS ANALYSIS OF GLUT1 | 第214-233页 |
| ·Introduction | 第214-218页 |
| ·Materials and methods | 第218-219页 |
| ·Data sets | 第218页 |
| ·Multiple sequence alignment, phylogenetic tree reconstruction and Ka/Ks analysis | 第218-219页 |
| ·Calculation of Consurf Conservation Scores | 第219页 |
| ·Results | 第219-230页 |
| ·GLUT gene repertoires in animals | 第219页 |
| ·Phylogenetic analysis of GLUT family | 第219-223页 |
| ·Ka/Ks analysis | 第223-225页 |
| ·Evolution analysis of GLUT1 (SLC2A1) | 第225-229页 |
| ·GLUT1 conservation | 第229-230页 |
| ·Discussion | 第230-233页 |
| ·Large Variation of GLUT Gene Repertoire in Vertebrate Species | 第230-231页 |
| ·Evolution of Vertebrate GLUT Genes | 第231-232页 |
| ·GLUT1 conservation in structure | 第232-233页 |
| CONCLUSIONS | 第233-235页 |
| ACKNOWLEDGEMENTS | 第235-236页 |
| REFERENCES | 第236-248页 |
| APPENDIX | 第248-255页 |
| A Buffers and solutions | 第248-255页 |
| B 在读期间已发表及待发表的文章 | 第255页 |
| C 在读期间负责和参研的课题 | 第255页 |
