| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 目录 | 第9-12页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-24页 |
| 1 黄瓜花叶病毒的概述 | 第12-16页 |
| ·寄主与症状表现 | 第12-13页 |
| ·株系与传播方式 | 第13-14页 |
| ·CMV基因组结构及其编码蛋白功能 | 第14-15页 |
| ·抗植物病毒基因工程 | 第15-16页 |
| 2 CMV 2b蛋白的功能研究 | 第16-19页 |
| ·转录后基因沉默(PTGS)抑制子 | 第16-18页 |
| ·其他功能 | 第18-19页 |
| 3 酵母双杂交系统 | 第19-20页 |
| ·酵母双杂交的原理 | 第19页 |
| ·酵母双杂交系统的特点 | 第19-20页 |
| 4 大肠杆菌双杂交系统 | 第20-21页 |
| ·基本原理 | 第20页 |
| ·大肠杆菌双杂交系统的特点 | 第20-21页 |
| 5 本研究的立题依据 | 第21-24页 |
| ·目的及意义 | 第21页 |
| ·主要研究内容 | 第21-22页 |
| ·研究技术路线 | 第22-24页 |
| 第二部分 酵母双杂交诱饵质粒的构建与自激活 | 第24-36页 |
| 1 材料与方法 | 第24-25页 |
| ·材料 | 第24-25页 |
| ·菌株和质粒 | 第24页 |
| ·表达载体图 | 第24-25页 |
| ·酶、抗体和化学试剂 | 第25页 |
| ·主要仪器设备 | 第25页 |
| 2 方法 | 第25-32页 |
| ·酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定 | 第25-29页 |
| ·寡核苷酸引物设计 | 第25-26页 |
| ·CMV 2b编码区PCR扩增 | 第26-27页 |
| ·attB-PCR产物的纯化 | 第27页 |
| ·BP重组构建入门克隆 | 第27页 |
| ·转化 | 第27页 |
| ·菌落PCR鉴定重组质粒 | 第27-28页 |
| ·质粒DNA提取 | 第28页 |
| ·测序 | 第28页 |
| ·pDONR~(TM)207-CMV 2b的双酶切 | 第28-29页 |
| ·LR重组反应 | 第29页 |
| ·转化 | 第29页 |
| ·菌落PCR鉴定重组质粒 | 第29页 |
| ·酵母双杂交诱饵质粒的自激活鉴定 | 第29-32页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第29-30页 |
| ·转化MaV203感受态细胞 | 第30页 |
| ·酵母菌株MaV203表型鉴定 | 第30页 |
| ·pDES~(TM)32-CMV 2b的毒性及自激活作用检测 | 第30-32页 |
| 3 结果与分析 | 第32-36页 |
| ·诱饵质粒pDEST~(TM)32-CMV 2b的构建与鉴定 | 第32-34页 |
| ·CMV 2b编码区PCR扩增 | 第32页 |
| ·诱饵质粒pDEST~(TM)32-CMV 2b构建及鉴定 | 第32-34页 |
| ·pDEST~(TM)32-CMV 2b诱饵质粒自激活鉴定 | 第34-36页 |
| ·酵母菌株MaV203表型鉴定 | 第34页 |
| ·诱饵质粒的毒性检测 | 第34页 |
| ·诱饵质粒的自激活作用检测 | 第34-36页 |
| 第三部分 大肠杆菌双杂交诱饵质粒的构建与自激活 | 第36-58页 |
| 1 材料与方法 | 第36-38页 |
| ·材料 | 第36-38页 |
| ·菌株和质粒 | 第36页 |
| ·表达载体图 | 第36-38页 |
| ·酶、抗体和化学试剂 | 第38页 |
| ·主要仪器设备 | 第38页 |
| 2 方法 | 第38-49页 |
| ·大肠杆菌双杂交诱饵质粒的构建及鉴定 | 第38-42页 |
| ·寡核苷酸引物的设计 | 第38-39页 |
| ·CMV 2b编码区PCR扩增 | 第39页 |
| ·PCR产物回收纯化 | 第39-40页 |
| ·PCR产物及pBT载体酶切回收 | 第40页 |
| ·连接反应 | 第40页 |
| ·超级感受态制备 | 第40-41页 |
| ·连接产物的转化 | 第41页 |
| ·质粒DNA提取 | 第41-42页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第42页 |
| ·重组质粒DNA序列测定 | 第42页 |
| ·λcI多克隆抗体的制备 | 第42-47页 |
| ·引物设计 | 第42-43页 |
| ·PCR扩增λcI基因 | 第43页 |
| ·回收纯化λcI基因的PCR产物 | 第43页 |
| ·PCR产物及pET-32载体酶切回收 | 第43页 |
| ·连接反应 | 第43-44页 |
| ·转化 | 第44页 |
| ·质粒DNA提取 | 第44页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第44页 |
| ·测序验证 | 第44页 |
| ·重组质粒pET-32-λcI的表达 | 第44页 |
| ·SDS-PAGE电泳及染色 | 第44-45页 |
| ·表达蛋白纯化 | 第45页 |
| ·纯化蛋白浓度的测定 | 第45-46页 |
| ·免疫兔子制备抗体 | 第46-47页 |
| ·ID-ELISA | 第47页 |
| ·诱饵质粒的表达与自激活鉴定 | 第47-49页 |
| ·诱饵质粒pBT-CMV 2b转化报告菌株 | 第47页 |
| ·报告菌株表达细胞的制备 | 第47页 |
| ·Western blot检测 | 第47-48页 |
| ·大肠杆菌双杂交系统诱饵质粒的自激活鉴定 | 第48-49页 |
| 3 结果与分析 | 第49-58页 |
| ·pBT-CMW 2b诱饵质粒的构建与鉴定 | 第49-51页 |
| ·CMV 2b编码区PCR扩增 | 第49页 |
| ·重组质粒pBT-CMV 2b酶切鉴定 | 第49-50页 |
| ·诱饵质粒pBT-CMV 2b的DNA序列分析 | 第50-51页 |
| ·λcI多克隆抗体的制备 | 第51-55页 |
| ·λcI编码区PCR扩增 | 第51-52页 |
| ·重组质粒pET-32-λcI双酶切和测序鉴定 | 第52-53页 |
| ·重组表达质粒pET-32-λcI诱导表达 | 第53页 |
| ·ID-ELISA验证效价 | 第53-55页 |
| ·诱饵质粒的表达与自激活鉴定 | 第55-58页 |
| ·pBT-CMV 2b的表达鉴定及λcI抗血清的应用 | 第55-56页 |
| ·诱饵质粒pBT-CMV 2b自激活作用检测 | 第56-58页 |
| 第四部分 讨论与结论 | 第58-64页 |
| 1 讨论 | 第58-62页 |
| ·2b蛋白的研究 | 第58-59页 |
| ·pDEST~(TM)32-CMV 2b诱饵质粒的构建与自激活 | 第59-60页 |
| ·pDEST~(TM)32-CMV 2b诱饵质粒的构建 | 第59页 |
| ·诱饵质粒pDEST~(TM)32-CMV 2b自激活鉴定 | 第59-60页 |
| ·pBT-CMV 2b诱饵质粒的构建与自激活鉴定 | 第60-61页 |
| ·pBT-CMV 2b诱饵质粒的构建 | 第60页 |
| ·诱饵质粒pBT-CMV 2b的表达鉴定 | 第60-61页 |
| ·诱饵质粒pBT-CMV 2b的自激活检测 | 第61页 |
| ·两种诱饵质粒构建的比较 | 第61-62页 |
| ·cDNA文库的构建 | 第62页 |
| 2 结论 | 第62-64页 |
| 参考文献 | 第64-72页 |
| 附录A 缩略词 | 第72-73页 |
| 附录B 常用试剂及缓冲液的配制 | 第73-75页 |
