| 摘要 | 第3-4页 |
| ABSTRACT | 第4页 |
| 第1章 文献综述 | 第8-16页 |
| 1.1 酿酒酵母基因组合成计划(Sc2.0) | 第8页 |
| 1.2 酿酒酵母的交配型及倍性 | 第8-12页 |
| 1.2.1 酿酒酵母的交配型及其转换 | 第8-10页 |
| 1.2.2 多倍体现象及多倍体酵母 | 第10-11页 |
| 1.2.3 非整倍体现象及非整倍体酵母 | 第11-12页 |
| 1.3 基因组重排SCRaMbLE系统 | 第12-13页 |
| 1.3.1 SCRaMbLE系统简介 | 第12页 |
| 1.3.2 SCRaMbLE系统在合成酵母染色体中的应用 | 第12-13页 |
| 1.4 本课题的主要研究内容及意义 | 第13-16页 |
| 第2章 材料与方法 | 第16-30页 |
| 2.1 实验材料 | 第16-21页 |
| 2.1.1 实验菌株及质粒 | 第16页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第16-17页 |
| 2.1.3 实验试剂 | 第17-19页 |
| 2.1.4 实验试剂配制 | 第19-21页 |
| 2.2 分子操作方法 | 第21-24页 |
| 2.2.1 CRISPR质粒构建方法 | 第22页 |
| 2.2.2 酵母质粒丢失方法 | 第22-23页 |
| 2.2.3 酿酒酵母基因组提取方法 | 第23页 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR方法 | 第23-24页 |
| 2.3 酿酒酵母生孢拆孢方法 | 第24-25页 |
| 2.4 酿酒酵母融合方法 | 第25页 |
| 2.5 酵母菌株交配型验证方法 | 第25-26页 |
| 2.5.1 PCR验证方法 | 第25页 |
| 2.5.2 tester菌验证方法 | 第25-26页 |
| 2.6 半乳糖诱导删除酵母染色体方法 | 第26-27页 |
| 2.7 流式细胞仪验证酵母的倍型 | 第27页 |
| 2.8 酵母菌株SCRaMbLE | 第27-28页 |
| 2.9 酵母菌株发酵及产物检测方法 | 第28-30页 |
| 2.9.1 菌株发酵方法 | 第28页 |
| 2.9.2 玉米黄质的提取方法 | 第28页 |
| 2.9.3 玉米黄质的检测方法 | 第28-30页 |
| 第3章 酵母交配型转换 | 第30-46页 |
| 3.1 引言 | 第30-31页 |
| 3.2 酵母交配型转换所需质粒的构建 | 第31-33页 |
| 3.2.1 gRNA表达质粒的构建 | 第31-32页 |
| 3.2.2 Donor DNA质粒的构建 | 第32-33页 |
| 3.3 MATa质粒的构建 | 第33页 |
| 3.4 CRISPR方法转换酵母交配型的效率 | 第33-37页 |
| 3.4.1 gRNA表达质粒的优化 | 第33-36页 |
| 3.4.2 CRISPR方法转换单倍体酵母交配型的效率 | 第36-37页 |
| 3.5 含多条合成型染色体的单倍体酵母菌株的构建 | 第37-40页 |
| 3.5.1 含多条合成型染色体的单倍体酵母菌株的构建 | 第37-38页 |
| 3.5.2 含多条合成型染色体的单倍体酵母菌株的验证 | 第38-39页 |
| 3.5.3 synV/synX单倍体酵母菌株的表征 | 第39-40页 |
| 3.6 多倍体酵母菌株的构建及验证 | 第40-44页 |
| 3.6.1 CRISPR方法转换二倍体酵母交配型的效率 | 第40-41页 |
| 3.6.2 野生型多倍体酵母菌株的构建 | 第41-42页 |
| 3.6.3 synV多倍体酵母菌株的构建 | 第42-43页 |
| 3.6.4 synV/synX多倍体酵母菌株的构建 | 第43-44页 |
| 3.7 小结 | 第44-46页 |
| 第4章 产玉米黄质多倍体酵母菌株的构建及重排 | 第46-64页 |
| 4.1 引言 | 第46页 |
| 4.2 玉米黄质整合质粒的构建 | 第46-48页 |
| 4.2.1 玉米黄质表达盒的构建 | 第46-47页 |
| 4.2.2 整合同源臂的构建 | 第47-48页 |
| 4.3 产玉米黄质酵母菌株的构建 | 第48-53页 |
| 4.3.1 产玉米黄质野生型酵母菌株的构建 | 第48-49页 |
| 4.3.2 产玉米黄质合成型酵母菌株的构建 | 第49-53页 |
| 4.4 合成型玉米黄质酵母菌株SCRaMbLE | 第53-56页 |
| 4.4.1 合成型玉米黄质多倍体酵母的重排 | 第53-54页 |
| 4.4.2 重排条件优化 | 第54-56页 |
| 4.5 重排菌株发酵及产量测定 | 第56-58页 |
| 4.5.1 SCRaMbLE后表型明显提升的菌株发酵 | 第57-58页 |
| 4.5.2 玉米黄质的提取及HPLC测定 | 第58页 |
| 4.6 PCRTag检测酵母染色体的变化 | 第58-59页 |
| 4.7 qPCR验证基因拷贝数的变化 | 第59-61页 |
| 4.8 重排菌株的传代稳定性 | 第61页 |
| 4.9 小结 | 第61-64页 |
| 第5章 产玉米黄质非整倍体酵母菌株的构建 | 第64-70页 |
| 5.1 引言 | 第64页 |
| 5.2 产玉米黄质重排酵母菌株的减数分裂 | 第64-66页 |
| 5.2.1 重排玉米黄质酵母菌株生孢 | 第64-65页 |
| 5.2.2 孢子倍型验证 | 第65-66页 |
| 5.3 PCRTag检测酵母染色体的变化 | 第66-67页 |
| 5.4 孢子发酵及产量HPLC检测 | 第67-68页 |
| 5.5 qPCR验证1.5倍体孢子的基因拷贝数 | 第68页 |
| 5.6 1.5倍体孢子的传代稳定性 | 第68-69页 |
| 5.7 小结 | 第69-70页 |
| 第6章 结论与展望 | 第70-72页 |
| 6.1 结论 | 第70-71页 |
| 6.2 展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-78页 |
| 附录A | 第78-86页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第86-88页 |
| 致谢 | 第88页 |
