| 摘要 | 第4-5页 |
| ABSTRACT | 第5页 |
| 文献综述 | 第10-17页 |
| 第一章 拟穴青蟹Myosin-9基因的克隆 | 第17-28页 |
| 1.1 试验材料与仪器 | 第17-18页 |
| 1.1.1 试验动物 | 第17页 |
| 1.1.2 试验试剂 | 第17页 |
| 1.1.3 试验仪器与试剂盒 | 第17-18页 |
| 1.2 试验方法 | 第18-23页 |
| 1.2.1 样品采集 | 第18页 |
| 1.2.2 血淋巴总RNA提取 | 第18-19页 |
| 1.2.3 cDNA末端快速扩增（RACE） | 第19-23页 |
| 1.2.3.1 引物设计 | 第19-20页 |
| 1.2.3.2 SMARTer RACE 5'/3'Kit合成第一链cDNA | 第20-21页 |
| 1.2.3.3 PCR与巢氏PCR进行序列扩增 | 第21页 |
| 1.2.3.4 DNA凝胶回收 | 第21-22页 |
| 1.2.3.5 Myosin-9基因片段克隆载体的连接与转化 | 第22-23页 |
| 1.2.3.6 菌液PCR | 第23页 |
| 1.2.3.7 测序与测序结果分析 | 第23页 |
| 1.3 试验结果分析 | 第23-26页 |
| 1.3.1 全长序列拼接与分析 | 第23-25页 |
| 1.3.2 氨基酸序列分析 | 第25页 |
| 1.3.3 进化树构建 | 第25-26页 |
| 1.4 讨论 | 第26-27页 |
| 1.5 小结 | 第27-28页 |
| 第二章 拟穴青蟹Myosin-9基因敲低及免疫功能探究 | 第28-45页 |
| 2.1 试验材料与仪器 | 第28-30页 |
| 2.1.1 试验动物 | 第28页 |
| 2.1.2 试验试剂 | 第28-29页 |
| 2.1.3 试验仪器与设备 | 第29-30页 |
| 2.2 试验方法 | 第30-36页 |
| 2.2.1 组织表达量检测 | 第30-31页 |
| 2.2.1.1 拟穴青蟹组织总RNA提取 | 第30页 |
| 2.2.1.2 cDNA合成 | 第30页 |
| 2.2.1.3 实时荧光定量PCR | 第30-31页 |
| 2.2.1.4 结果分析 | 第31页 |
| 2.2.2 dsRNA质粒构建 | 第31-32页 |
| 2.2.2.1 HT115感受态细胞的制备 | 第31-32页 |
| 2.2.2.2 表达载体引物设计 | 第32页 |
| 2.2.2.3 融合表达载体 | 第32页 |
| 2.2.3 Myosin-9-dsRNA的诱导表达 | 第32-34页 |
| 2.2.3.1 dsRNA提取 | 第33页 |
| 2.2.3.2 dsRNA退火 | 第33页 |
| 2.2.3.3 dsRNA纯化 | 第33页 |
| 2.2.3.4 dsRNA纯度检测 | 第33-34页 |
| 2.2.4 Myosin-9-dsRNA干扰效果检测 | 第34页 |
| 2.2.4.1 RNA提取 | 第34页 |
| 2.2.4.2 cDNA合成 | 第34页 |
| 2.2.4.3 实时荧光定量检测 | 第34页 |
| 2.2.5 免疫基因检测 | 第34-35页 |
| 2.2.5.1 引物设计 | 第34-35页 |
| 2.2.5.2 dsRNA注射处理 | 第35页 |
| 2.2.5.3 RNA提取 | 第35页 |
| 2.2.5.4 cDNA合成 | 第35页 |
| 2.2.5.5 实时荧光定量检测 | 第35页 |
| 2.2.6 免疫活性检测 | 第35-36页 |
| 2.2.6.1 dsRNA注射处理 | 第35页 |
| 2.2.6.2 血细胞总数（THC）检测 | 第35-36页 |
| 2.2.6.3 酚氧化酶（PO）活性 | 第36页 |
| 2.2.6.4 超氧化物歧化酶（SOD）活性 | 第36页 |
| 2.2.7 数据统计 | 第36页 |
| 2.3 试验结果 | 第36-42页 |
| 2.3.1 Myosin-9组织表达差异性分析 | 第36-37页 |
| 2.3.2 dsRNA体外试验干扰Myosin-9表达 | 第37-39页 |
| 2.3.2.1 Myosin-9-dsRNA质粒构建 | 第37-38页 |
| 2.3.2.2 dsRNA纯度检测结果 | 第38页 |
| 2.3.2.3 Myosin-9-dsRNA干扰效果检测 | 第38-39页 |
| 2.3.2.4 Myosin-9-dsRNA干扰时效检测 | 第39页 |
| 2.3.3 重要免疫相关基因的表达量检测 | 第39-40页 |
| 2.3.4 免疫活性检测 | 第40-42页 |
| 2.3.4.1 血细胞总数（THC）检测 | 第40-41页 |
| 2.3.4.2 酚氧化酶（PO）活性 | 第41页 |
| 2.3.4.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性 | 第41-42页 |
| 2.4 讨论 | 第42-43页 |
| 2.5 小结 | 第43-45页 |
| 第三章 沉默Myosin-9基因对拟穴青蟹抗菌活性的影响 | 第45-57页 |
| 3.1 试验材料与仪器 | 第45-47页 |
| 3.1.1 试验动物 | 第45页 |
| 3.1.2 试验试剂 | 第45-46页 |
| 3.1.3 试验仪器与所需试剂盒 | 第46-47页 |
| 3.2 试验方法 | 第47-50页 |
| 3.2.1 病原诱导表达变化分析 | 第47页 |
| 3.2.1.1 拟穴青蟹攻毒处理 | 第47页 |
| 3.2.1.2 RNA提取 | 第47页 |
| 3.2.1.3 cDNA合成 | 第47页 |
| 3.2.1.4 实时荧光定量检测 | 第47页 |
| 3.2.1.5 结果分析 | 第47页 |
| 3.2.2 Kaplan-Meier生存分析试验 | 第47-48页 |
| 3.2.2.1 dsRNA及攻毒处理 | 第47页 |
| 3.2.2.2 分组设计 | 第47页 |
| 3.2.2.3 死亡率数据统计 | 第47-48页 |
| 3.2.3 吞噬试验 | 第48页 |
| 3.2.3.1 FITC标记V.alginolyticus | 第48页 |
| 3.2.3.2 细胞吞噬 | 第48页 |
| 3.2.4 免疫活性检测 | 第48-49页 |
| 3.2.5 Myosin-9对细胞凋亡的影响 | 第49-50页 |
| 3.2.6 数据统计 | 第50页 |
| 3.3 试验结果 | 第50-55页 |
| 3.3.1 病原诱导 Myosin-9基因表达变化 | 第50-51页 |
| 3.3.2 Kaplan-Meier生存分析试验 | 第51页 |
| 3.3.3 Myosin-9对细胞吞噬作用的影响 | 第51-52页 |
| 3.3.4 免疫活性检测 | 第52-54页 |
| 3.3.5 Myosin-9对细胞凋亡的影响 | 第54-55页 |
| 3.4 讨论 | 第55-56页 |
| 3.5 小结 | 第56-57页 |
| 第四章 沉默Myosin-9基因对拟穴青蟹抗病毒作用的影响 | 第57-73页 |
| 4.1 试验材料与仪器 | 第57-59页 |
| 4.1.1 试验动物 | 第57页 |
| 4.1.2 试验试剂 | 第57-58页 |
| 4.1.3 试验设备与所需试剂盒 | 第58-59页 |
| 4.2 试验方法 | 第59-62页 |
| 4.2.1 病原诱导Myosin-9表达变化分析 | 第59页 |
| 4.2.1.1 实验材料处理 | 第59页 |
| 4.2.1.2 RNA提取 | 第59页 |
| 4.2.1.3 cDNA合成 | 第59页 |
| 4.2.1.4 实时荧光定量检测 | 第59页 |
| 4.2.1.5 结果分析 | 第59页 |
| 4.2.2 WSSV提取与纯化 | 第59页 |
| 4.2.3 病毒拷贝数检测 | 第59-61页 |
| 4.2.3.1 病毒注射处理 | 第59-60页 |
| 4.2.3.2 基因组DNA提取 | 第60页 |
| 4.2.3.3 病毒拷贝数检测 | 第60页 |
| 4.2.3.4 数据分析 | 第60-61页 |
| 4.2.4 免疫活性检测 | 第61页 |
| 4.2.5 Kaplan-Meier生存分析试验 | 第61页 |
| 4.2.5.1 dsRNA及攻毒处理 | 第61页 |
| 4.2.5.2 分组设计 | 第61页 |
| 4.2.6 细胞吞噬试验 | 第61-62页 |
| 4.2.6.1 WSSV病毒灭活 | 第61页 |
| 4.2.6.2 FITC标记病毒 | 第61-62页 |
| 4.2.6.3 流式细胞术计算吞噬百分率 | 第62页 |
| 4.2.7 血细胞凋亡 | 第62页 |
| 4.2.8 数据统计 | 第62页 |
| 4.3 试验结果 | 第62-70页 |
| 4.3.1 病原诱导表达变化分析 | 第62-63页 |
| 4.3.2 免疫活性检测 | 第63-65页 |
| 4.3.3 WSSV提取 | 第65-66页 |
| 4.3.4 WSSV拷贝数检测 | 第66-67页 |
| 4.3.5 Kaplan-Meier生存分析试验 | 第67-68页 |
| 4.3.6 Myosin-9对细胞吞噬作用的影响 | 第68-69页 |
| 4.3.6.1 Myosin-9对细胞吞噬的影响 | 第68-69页 |
| 4.3.7 Myosin-9对细胞凋亡的影响 | 第69-70页 |
| 4.4 讨论 | 第70-71页 |
| 4.5 小结 | 第71-73页 |
| 第五章 全文总结 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-80页 |
| 个人简介 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
