| 中文摘要 | 第12-14页 |
| ABSTRACT | 第14-15页 |
| 第一章 绪论 | 第16-26页 |
| 1.1 生物中的N-糖基化系统 | 第16-21页 |
| 1.1.1 微生物中蛋白糖基化 | 第16-18页 |
| 1.1.2 蛋白质的整体N-糖基化 | 第18-19页 |
| 1.1.3 蛋白质的连续N-糖基化 | 第19-20页 |
| 1.1.4 糖基转移酶(Glycosyltransferases,GTs) | 第20-21页 |
| 1.2 糖缀合物疫苗 | 第21-24页 |
| 1.2.1 细菌多糖 | 第21-22页 |
| 1.2.2 糖蛋白 | 第22页 |
| 1.2.3 细菌多糖疫苗 | 第22-23页 |
| 1.2.4 糖缀合物疫苗 | 第23-24页 |
| 1.3 细菌多糖合酶依赖型糖蛋白疫苗 | 第24-26页 |
| 1.3.1 肺炎链球菌3型荚膜多糖 | 第24-25页 |
| 1.3.2 肺炎链球菌荚膜多糖合成机制 | 第25页 |
| 1.3.3 肺炎链球菌3型多糖合成酶(Cps3S) | 第25-26页 |
| 第二章 不同来源的N-糖基转移酶肽底物特异性 | 第26-50页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-31页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第27页 |
| 2.1.2 主要试剂和耗材 | 第27-28页 |
| 2.1.3 主要仪器 | 第28-29页 |
| 2.1.4 主要培养基和缓冲液的配置 | 第29-31页 |
| 2.2 实验方法 | 第31-41页 |
| 2.2.1 不同来源NGT的序列比对 | 第31页 |
| 2.2.2 不同来源的NGT的诱导表达 | 第31-32页 |
| 2.2.3 不同来源的NGT的纯化 | 第32页 |
| 2.2.4 不同来源NGT的检测 | 第32-33页 |
| 2.2.5 不同来源的NGT蛋白浓度的测定 | 第33页 |
| 2.2.6 不同来源NGT体外酶活的测定 | 第33-34页 |
| 2.2.7 KkNGT酶学性质的测定 | 第34-35页 |
| 2.2.8 不同来源NGT肽底物特异性的比较 | 第35-37页 |
| 2.2.9 BtNGT的C末端缺失突变体(BtNGTct)的探究 | 第37-41页 |
| 2.2.9.1. 质粒pET22b | 第37页 |
| 2.2.9.2. C末端缺失突变体的目的基因的获得 | 第37-38页 |
| 2.2.9.3. 构建载体pET22b- BtNGTct | 第38-40页 |
| 2.2.9.4. BtNGT C末端截短对糖供体的影响 | 第40-41页 |
| 2.3 实验结果 | 第41-48页 |
| 2.3.1 NGT的鉴定 | 第41-42页 |
| 2.3.2 不同来源NGT的纯化与检测 | 第42页 |
| 2.3.3 不同来源NGT酶活测定 | 第42-43页 |
| 2.3.4 KkNGT酶学性质的测定 | 第43-45页 |
| 2.3.5 不同来源NGT肽底物特异性的比较 | 第45-46页 |
| 2.3.6 BtNGT的C末端缺失突变体(BtNGTct)的探究 | 第46-48页 |
| 2.4 讨论 | 第48-50页 |
| 第三章 基于NGT糖基化途径的蛋白N-糖基化修饰 | 第50-76页 |
| 3.1 实验材料 | 第51-52页 |
| 3.1.1 菌株和载体 | 第51页 |
| 3.1.2 主要试剂和耗材 | 第51页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第51-52页 |
| 3.1.4 主要培养基和缓冲液的配置 | 第52页 |
| 3.2 实验方法 | 第52-60页 |
| 3.2.1 构建株E. coli DH5α(pET28a-CRM197-AaNGT) | 第52-55页 |
| 3.2.2 pET28a-CRM197-AaNGT重组子的表达及纯化 | 第55页 |
| 3.2.3 糖基化蛋白CRM197的Western-Blot验证 | 第55页 |
| 3.2.4 MALDI-TOF鉴定分析重组蛋白的糖基化 | 第55-56页 |
| 3.2.5 构建菌株E.coli DH5α( pRSFDuet-FHT-AaNGT) | 第56-58页 |
| 3.2.6 单糖基化FHT-Glc蛋白的表达及纯化 | 第58页 |
| 3.2.7 重组蛋白的糖基化鉴定分析 | 第58页 |
| 3.2.8 α-1,6-葡糖基转移酶(α1,6GlcT)的应用 | 第58-60页 |
| 3.3 实验结果 | 第60-74页 |
| 3.3.1 菌株E. coli DH5α (pET28a-CRM197-AaNGT)的验证 | 第60-62页 |
| 3.3.2 pET28a-CRM197-AaNGT重组子的表达及纯化 | 第62-63页 |
| 3.3.3 重组蛋白CRM197糖基化的MALDI-TOF鉴定分析 | 第63-64页 |
| 3.3.4 菌株E.coli DH5α( pRSFDuet-FHT-AaNGT)的验证 | 第64-66页 |
| 3.3.5 FHT及单糖基化蛋白FHT-Glc的表达及纯化 | 第66-67页 |
| 3.3.6 FHT及FHT-Glc的MALDI-TOF鉴定分析 | 第67-69页 |
| 3.3.7 α-1,6-葡糖基转移酶(α1,6GlcT)的应用 | 第69-74页 |
| 3.4 讨论 | 第74-76页 |
| 第四章 肺炎链球菌3型细菌胞外多糖合成酶初步探究 | 第76-84页 |
| 4.1 实验材料 | 第77页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第77页 |
| 4.1.2 主要试剂和耗材 | 第77页 |
| 4.1.3 主要仪器 | 第77页 |
| 4.1.4 主要培养基和缓冲液的配置 | 第77页 |
| 4.2 实验方法 | 第77-79页 |
| 4.2.1 Cps3S的表达及纯化 | 第77-78页 |
| 4.2.2 Cps3S跨膜端缺失后的载体构建与表达纯化 | 第78-79页 |
| 4.3 实验结果 | 第79-82页 |
| 4.3.1 Cps3S的表达及纯化 | 第79-80页 |
| 4.3.2 Cps3S跨膜端缺失后的载体构建 | 第80-81页 |
| 4.3.3 Cps3S跨膜端缺失后的表达纯化 | 第81-82页 |
| 4.4 讨论 | 第82-84页 |
| 全文总结 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-96页 |
| 致谢 | 第96-98页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第98-99页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第99页 |
