| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 1 引言 | 第17-41页 |
| 1.1 绵羊肺腺瘤病概述 | 第17页 |
| 1.2 绵羊肺腺瘤病的发现与病原学 | 第17-29页 |
| 1.2.1 绵羊肺腺瘤病的发现与分布 | 第17-18页 |
| 1.2.2 OPA病原的确定与分类 | 第18-19页 |
| 1.2.3 JSRV的形态及理化性质 | 第19-20页 |
| 1.2.4 JSRV基因结构及其编码的蛋白 | 第20-23页 |
| 1.2.4.1 gag基因及其编码的蛋白 | 第21页 |
| 1.2.4.2 pro和pol基因及其编码的蛋白 | 第21-22页 |
| 1.2.4.3 orf-x基因 | 第22页 |
| 1.2.4.4 env基因及其编码的蛋白 | 第22-23页 |
| 1.2.4.5 长末端重复序列 | 第23页 |
| 1.2.5 JSRV的转化机制 | 第23-24页 |
| 1.2.6 JSRV复制生活周期 | 第24-25页 |
| 1.2.7 内源性绵羊肺腺瘤病毒的作用 | 第25-28页 |
| 1.2.8 内外源性JSRV基因组遗传的差异 | 第28-29页 |
| 1.3 绵羊肺腺瘤病的流行病学 | 第29-31页 |
| 1.3.1 绵羊肺腺瘤病的流行特征 | 第29-30页 |
| 1.3.2 绵羊肺腺瘤病的传播途径、传染源、易感动物 | 第30-31页 |
| 1.4 绵羊肺腺瘤病的临床特征及病理变化 | 第31-34页 |
| 1.4.1 绵羊肺腺瘤病的临床特征 | 第31-32页 |
| 1.4.2 绵羊肺腺瘤病的病理学观察 | 第32-34页 |
| 1.5 OPA作为动物模型的意义 | 第34页 |
| 1.6 人类肺癌与JSRV的关系 | 第34-35页 |
| 1.7 绵羊肺腺瘤病的防治 | 第35-37页 |
| 1.8 绵羊肺腺瘤病的检测方法 | 第37-39页 |
| 1.9 研究目的及意义 | 第39-41页 |
| 2 实验一 绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位预测 | 第41-63页 |
| 2.1 材料 | 第41页 |
| 2.1.1 实验材料 | 第41页 |
| 2.2 方法 | 第41-42页 |
| 2.2.1 JSRV-NM株囊膜基因序列比对与稀有密码子分析 | 第41-42页 |
| 2.2.2 JSRV-NM株囊膜蛋白二级结构的预测 | 第42页 |
| 2.2.3 JSRV-NM株囊膜蛋白B细胞抗原表位的预测 | 第42页 |
| 2.3 结果 | 第42-59页 |
| 2.3.1 JSRV-NM株囊膜基因序列比对结果 | 第42-49页 |
| 2.3.2 JSRV-NM株囊膜基因稀有密码子分析结果 | 第49-50页 |
| 2.3.3 JSRV-NM株囊膜蛋白二级结构的预测结果 | 第50-54页 |
| 2.3.4 JSRV-NM株囊膜蛋白B细胞抗原表位的预测结果 | 第54-59页 |
| 2.4 讨论 | 第59-61页 |
| 2.5 小结 | 第61-63页 |
| 3 实验二 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白全长与截短蛋白的表达与鉴定 | 第63-100页 |
| 3.1 材料 | 第63-66页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第63页 |
| 3.1.2 实验仪器 | 第63-64页 |
| 3.1.3 实验试剂 | 第64-66页 |
| 3.2 方法 | 第66-76页 |
| 3.2.1 引物的设计合成与目的片段的PCR扩增 | 第66-68页 |
| 3.2.1.1 引物的设计合成 | 第66页 |
| 3.2.1.2 RNA的提取及质量的鉴定 | 第66-67页 |
| 3.2.1.3 总RNA样品的反转录及PCR反应 | 第67-68页 |
| 3.2.2 原核表达质粒的构建 | 第68-71页 |
| 3.2.2.1 载体质粒的制备 | 第68-69页 |
| 3.2.2.2 酶切 | 第69-70页 |
| 3.2.2.3 目的片段和表达载体的连接 | 第70页 |
| 3.2.2.4 重组表达质粒的转化 | 第70-71页 |
| 3.2.3 重组原核表达质粒的鉴定 | 第71-72页 |
| 3.2.3.1 阳性克隆的PCR筛选 | 第71页 |
| 3.2.3.2 重组原核表达质粒酶切鉴定 | 第71-72页 |
| 3.2.3.3 阳性菌的保存及重组表达质粒的测序 | 第72页 |
| 3.2.4 重组蛋白的原核表达与可溶性鉴定 | 第72-73页 |
| 3.2.5 重组蛋白的Westernblot鉴定 | 第73-74页 |
| 3.2.6 重组蛋白最佳诱导表达条件的确定 | 第74页 |
| 3.2.7 重组蛋白纯化条件的确定 | 第74-76页 |
| 3.3 结果 | 第76-97页 |
| 3.3.1 目的基因的PCR扩增结果 | 第76-77页 |
| 3.3.2 重组表达质粒的菌液PCR与酶切鉴定结果 | 第77-82页 |
| 3.3.3 重组质粒测序结果 | 第82-88页 |
| 3.3.4 重组蛋白的表达及可溶性鉴定结果 | 第88-91页 |
| 3.3.5 重组蛋白的Westernblot鉴定结果 | 第91-92页 |
| 3.3.6 重组蛋白的最佳诱导表达条件 | 第92-95页 |
| 3.3.7 重组蛋白的纯化条件 | 第95-97页 |
| 3.4 讨论 | 第97-99页 |
| 3.5 小结 | 第99-100页 |
| 4 实验三 JSRV Env_(51-394)和JSRV Env多克隆抗体的制备、纯化和鉴定 | 第100-113页 |
| 4.1 材料 | 第100-102页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第100页 |
| 4.1.2 实验仪器 | 第100-101页 |
| 4.1.3 实验试剂 | 第101-102页 |
| 4.2 实验方法 | 第102-106页 |
| 4.2.1 动物的免疫及间接ELISA方法建立 | 第102-104页 |
| 4.2.2 多克隆抗体效价的测定 | 第104页 |
| 4.2.3 多克隆抗体的纯化 | 第104页 |
| 4.2.4 多克隆抗体的Westernbolt鉴定 | 第104-105页 |
| 4.2.5 多克隆抗体的免疫组织化学鉴定 | 第105-106页 |
| 4.3 实验结果 | 第106-111页 |
| 4.3.1 动物免疫与间接ELISA方法建立结果 | 第106-107页 |
| 4.3.2 多克隆抗体效价测定结果 | 第107-108页 |
| 4.3.3 多克隆抗体纯化结果 | 第108-109页 |
| 4.3.4 多克隆抗体的Westernbolt鉴定结果 | 第109-110页 |
| 4.3.5 多克隆抗体的免疫组织化学鉴定结果 | 第110-111页 |
| 4.4 讨论 | 第111-112页 |
| 4.5 小结 | 第112-113页 |
| 5 实验四 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白胞质尾区单克隆抗体的制备 | 第113-143页 |
| 5.1 材料 | 第113-115页 |
| 5.1.1 实验材料 | 第113页 |
| 5.1.2 实验仪器 | 第113-114页 |
| 5.1.3 实验试剂 | 第114-115页 |
| 5.2 方法 | 第115-124页 |
| 5.2.1 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白三级结构的预测 | 第115页 |
| 5.2.2 绵羊肺腺瘤病毒胞质尾区多肽的合成 | 第115-116页 |
| 5.2.3 间接ELISA检测方法的建立 | 第116页 |
| 5.2.4 动物免疫 | 第116页 |
| 5.2.5 杂交瘤细胞株的建立与筛选 | 第116-118页 |
| 5.2.6 单克隆抗体亚类鉴定与分泌稳定性 | 第118-119页 |
| 5.2.7 杂交瘤细胞的染色体分析 | 第119页 |
| 5.2.8 单克隆抗体的相加ELISA分析 | 第119-120页 |
| 5.2.9 单克隆抗体相对亲和力的测定 | 第120页 |
| 5.2.10 单克隆抗体腹水的制备、效价测定 | 第120页 |
| 5.2.11 单克隆抗体的纯化 | 第120-121页 |
| 5.2.12 单克隆抗体Westernblot鉴定 | 第121页 |
| 5.2.13 单克隆抗体免疫组织化学鉴定 | 第121-122页 |
| 5.2.14 单克隆抗体检测羊外周血白细胞 | 第122-124页 |
| 5.3 结果 | 第124-139页 |
| 5.3.1 绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白三级结构预测结果 | 第124-125页 |
| 5.3.2 多肽合成结果 | 第125-126页 |
| 5.3.3 间接ELISA检测方法建立的结果 | 第126-127页 |
| 5.3.4 动物免疫结果 | 第127-128页 |
| 5.3.5 杂交瘤细胞株筛选、单克隆抗体亚类鉴定及分泌稳定性结果 | 第128-129页 |
| 5.3.6 杂交瘤细胞的染色体分析结果 | 第129-131页 |
| 5.3.7 腹水制备及抗体效价测定结果 | 第131页 |
| 5.3.8 抗体相加ELISA分析结果 | 第131-132页 |
| 5.3.9 单克隆抗体相对亲和力测定结果 | 第132页 |
| 5.3.10 单克隆抗体的纯化结果 | 第132-133页 |
| 5.3.11 单克隆抗体Westernblot鉴定结果 | 第133-134页 |
| 5.3.12 单克隆抗体免疫组织化学鉴定结果 | 第134-135页 |
| 5.3.13 单克隆抗体检测羊外周血白细胞结果 | 第135-139页 |
| 5.4 讨论 | 第139-142页 |
| 5.5 小结 | 第142-143页 |
| 6 实验五 JSRV囊膜蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立、评价与初步临床应用 | 第143-158页 |
| 6.1 材料 | 第143-144页 |
| 6.1.1 实验材料 | 第143页 |
| 6.1.2 实验仪器 | 第143页 |
| 6.1.3 实验试剂 | 第143-144页 |
| 6.2 实验方法 | 第144-147页 |
| 6.2.1 双抗体夹心ELISA检测方法的建立 | 第144-146页 |
| 6.2.1.1 包被用多克隆抗体和检测用单克隆抗体稀释度的确定 | 第144-145页 |
| 6.2.1.2 最佳包被条件的确定 | 第145页 |
| 6.2.1.3 最佳封闭液的确定 | 第145页 |
| 6.2.1.4 封闭时间的确定 | 第145-146页 |
| 6.2.1.5 样品反应时间的确定 | 第146页 |
| 6.2.1.6 底物反应时间的确定 | 第146页 |
| 6.2.2 双抗体夹心ELISA检测方法的评价 | 第146-147页 |
| 6.2.2.1 特异性评价 | 第146页 |
| 6.2.2.2 敏感性评价 | 第146-147页 |
| 6.2.2.3 重复性与稳定性评价 | 第147页 |
| 6.2.3 JSRV囊膜蛋白的双抗体夹心ELISA方法的初步应用 | 第147页 |
| 6.2.3.1 临床样品的双抗体夹心ELISA检测 | 第147页 |
| 6.2.3.2 ELISA阳性样品的Westernblot检测验证 | 第147页 |
| 6.3 结果 | 第147-155页 |
| 6.3.1 双抗体夹心ELISA检测方法的建立结果 | 第147-150页 |
| 6.3.2 双抗体夹心ELISA检测方法的评价结果 | 第150-153页 |
| 6.3.2.1 特异性实验结果 | 第150页 |
| 6.3.2.2 敏感性实验结果 | 第150-151页 |
| 6.3.2.3 重复性与稳定性实验结果 | 第151-153页 |
| 6.3.3 JSRV囊膜蛋白双抗体夹心ELISA方法初步应用 | 第153-155页 |
| 6.3.3.1 双抗体夹心ELISA检测临床样品的结果 | 第153-154页 |
| 6.3.3.2 ELISA阳性样品的Westernblot检测验证 | 第154-155页 |
| 6.4 讨论 | 第155-157页 |
| 6.5 小结 | 第157-158页 |
| 7 结论 | 第158-159页 |
| 8 研究创新点与不足之处 | 第159-160页 |
| 8.1 研究创新点 | 第159页 |
| 8.2 研究不足之处 | 第159-160页 |
| 致谢 | 第160-161页 |
| 参考文献 | 第161-181页 |
| 作者简介 | 第181页 |
