| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 缩略词 | 第15页 |
| 主要抗体及激动剂 | 第15-16页 |
| 主要试剂 | 第16-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-27页 |
| 1.1 失眠 | 第17-18页 |
| 1.3 中药是促睡眠新药的重要来源 | 第18-20页 |
| 1.3.1 目前市售安眠药有较强的毒副作用 | 第19页 |
| 1.3.2 三七、五味子对中枢神经系统的作用 | 第19-20页 |
| 1.4 G蛋白偶联受体(G PROTEIN-COUPLED RECEPTORS,GPCRs) -腺苷受体 | 第20-23页 |
| 1.4.1 人类睡眠与G蛋白偶联受体的关系 | 第21-22页 |
| 1.4.2 腺苷受体与睡眠的关系 | 第22-23页 |
| 1.4.3 腺苷受体与中药中镇静安神成分的关系 | 第23页 |
| 1.5 荧光共振能量转移(THE FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER;FRET) | 第23-26页 |
| 1.6 本实验研究路线 | 第26-27页 |
| 第二章 腺苷受体A1和A2A分子探针的构建 | 第27-60页 |
| 引言 | 第27页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-30页 |
| 2.1.1 实验细胞 | 第27页 |
| 2.1.2 实验主要试剂及配方 | 第27-29页 |
| 2.1.3 实验主要材料与仪器 | 第29-30页 |
| 2.2 实验方法 | 第30-41页 |
| 2.2.1 PCR引物 | 第30-31页 |
| 2.2.2 PCR体系 | 第31-32页 |
| 2.2.3 PCR产物胶回收 | 第32-33页 |
| 2.2.4 胶回收产物连接 | 第33页 |
| 2.2.5 连接产物转化并摇菌 | 第33页 |
| 2.2.6 质粒的提取 | 第33页 |
| 2.2.7 质粒的鉴定与测序 | 第33页 |
| 2.2.8 酶切体系(10ML) | 第33-34页 |
| 2.2.9 293T CELL的传代及培养 | 第34页 |
| 2.2.10 293T CELL的冻存 | 第34页 |
| 2.2.11 孔板经多聚赖氨酸的包被方法 | 第34页 |
| 2.2.12 293T CELL铺板 | 第34-35页 |
| 2.2.13 瞬时转染 | 第35页 |
| 2.2.14 FLP-IN T-REX 293T CELL培养及传代 | 第35页 |
| 2.2.15 FLP-IN T-REX 293TCELL冻存 | 第35页 |
| 2.2.16 POG 44质粒的大量提取 | 第35-36页 |
| 2.2.17 FLP-IN T-REX 293TcELL铺板 | 第36页 |
| 2.2.18 FLP-IN T-REX 293T CELL的稳定转染 | 第36页 |
| 2.2.19 稳定细胞系的筛选 | 第36-37页 |
| 2.2.20 稳定细胞系的维持 | 第37页 |
| 2.2.21 稳定细胞系的传代 | 第37页 |
| 2.2.22 稳定细胞系的正常培养 | 第37页 |
| 2.2.23 野生型腺苷受体A1和A2A的鉴定-WESTERN-BLOT | 第37-41页 |
| 2.3 实验结果 | 第41-51页 |
| 2.3.1 含有荧光标签腺苷受体A1和A2A分子探针的构建 | 第41-46页 |
| 2.3.2 瞬时转染荧光检测 | 第46-47页 |
| 2.3.3 瞬时转染WESTERN-BLOT对含有荧光标签分钟自探针ERK活性的检测 | 第47-50页 |
| 2.3.4 结果与讨论 | 第50-51页 |
| 2.4 腺苷受体A1和A2A分子探针稳定珠的构建 | 第51-60页 |
| 2.4.1 稳定细胞系的荧光检测 | 第51-54页 |
| 2.4.2 稳定细胞系的鉴定-WESTERN-BLOT | 第54-59页 |
| 2.4.3 结果与讨论 | 第59-60页 |
| 第三章 荧光共振能量转移( THE FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER;FRET)对三七、五味子的初步筛选 | 第60-73页 |
| 引言 | 第60页 |
| 3.1 实验材料 | 第60-61页 |
| 3.1.1 实验细胞 | 第60页 |
| 3.1.2 实验主要材料 | 第60-61页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第61页 |
| 3.2 实验方法 | 第61-63页 |
| 3.2.1 高速荧光显微镜操作流程 | 第61-62页 |
| 3.2.2 稳定细胞系做FRET曲线时载玻片的处理 | 第62页 |
| 3.2.3 稳定细胞系的铺板 | 第62页 |
| 3.2.4 稳定细胞系的诱导 | 第62页 |
| 3.2.5 稳定细胞系荧光的检测-高速荧光显微镜操作步骤 | 第62页 |
| 3.2.6 中药浸膏的提取与保存 | 第62-63页 |
| 3.3 实验结果 | 第63-73页 |
| 3.3.1 用荧光分子探针稳定细胞系检测中药中活性成分 | 第63-66页 |
| 3.3.2 中药刺激时FRET曲线变动 | 第66-72页 |
| 3.3.3 实验结果与讨论 | 第72-73页 |
| 第四章 非荧光基团腺苷受体A1和A2A对分子探针有效性的检测 | 第73-82页 |
| 引言 | 第73页 |
| 4.1 实验材料 | 第73页 |
| 4.1.1 实验细胞 | 第73页 |
| 4.1.2 实验主要试剂 | 第73页 |
| 4.1.3 实验主要仪器 | 第73页 |
| 4.2 实验方法 | 第73-77页 |
| 4.2.1 点突变引物设计 | 第73-74页 |
| 4.2.2 点突变PCR | 第74页 |
| 4.2.3 点突变去甲基化及产物链接 | 第74页 |
| 4.2.4 连接产物转化并摇菌 | 第74-75页 |
| 4.2.5 质粒的提取 | 第75页 |
| 4.2.6 质粒的测序 | 第75页 |
| 4.2.7 FLP-IN T-REx 293T CELL培养及传代 | 第75页 |
| 4.2.8 FLP-IN T-REX 293T CELL冻存 | 第75页 |
| 4.2.9 POG 44质粒的大量提取 | 第75页 |
| 4.2.10 FLP-IN T-REX 293T CELL铺板 | 第75页 |
| 4.2.11 FLP-IN T-REX 293T CELL的稳定转染 | 第75页 |
| 4.2.12 稳定细胞系的筛选 | 第75页 |
| 4.2.13 稳定细胞系的维持 | 第75-76页 |
| 4.2.14 稳定细胞系的传代 | 第76页 |
| 4.2.15 稳定细胞系的正常培养 | 第76页 |
| 4.2.16 非荧光基团腺苷受体A1和A2A的鉴定及其对三七、五味子中有效成分的鉴定-WESTERN-BLOT | 第76页 |
| 4.2.17 中药浸膏的提取与保存 | 第76-77页 |
| 4.3 实验结果 | 第77-81页 |
| 4.3.1 非荧光腺苷受体A1和A2A分子探针的构建 | 第77-78页 |
| 4.3.2 BCA试剂盒蛋白定量曲线: | 第78-79页 |
| 4.3.3 稳定珠诱导后VSV标签的检测结果 | 第79-80页 |
| 4.3.4 中药提取物对非荧光腺苷受体ERK磷酸化水平检测 | 第80-81页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第81-82页 |
| 第五章 结论与展望 | 第82-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 参考文献 | 第84-90页 |
| 附录A 攻读硕士期间所得成果 | 第90页 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 | 第90页 |
| 攻读硕士期间基金获得情况 | 第90页 |
| 攻读硕士期间论著情况 | 第90页 |
