| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 目录 | 第7-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-42页 |
| 1.1 病毒干扰现象 | 第11页 |
| 1.2 干扰素的早期研究 | 第11-12页 |
| 1.3 干扰素系统概述 | 第12页 |
| 1.4 脊椎动物IFN | 第12-22页 |
| 1.4.1 Ⅰ型IFN | 第13-19页 |
| 1.4.1.1 IFN-α | 第15页 |
| 1.4.1.2 IFN-β | 第15-16页 |
| 1.4.1.3 IFN-ω | 第16页 |
| 1.4.1.4 IFN-τ | 第16页 |
| 1.4.1.5 IFN-δ | 第16-17页 |
| 1.4.1.6 IFN-κ | 第17页 |
| 1.4.1.7 IFN-ε | 第17-18页 |
| 1.4.1.8 IFN-ζ | 第18页 |
| 1.4.1.9 IFN-υ | 第18-19页 |
| 1.4.2 Ⅱ型IFN | 第19-21页 |
| 1.4.3 Ⅳ型IFN | 第21-22页 |
| 1.5 鱼类IFN | 第22-38页 |
| 1.5.1 鱼类IFN的早期研究 | 第22-23页 |
| 1.5.2 鱼类Ⅰ型IFN | 第23-26页 |
| 1.5.2.1 鱼类Ⅰ型IN的发现及其结构特点 | 第23-24页 |
| 1.5.2.2 鱼类Ⅰ型IFN的转录变异体 | 第24页 |
| 1.5.2.3 鱼类Ⅰ型IFN表达的转录调控 | 第24-25页 |
| 1.5.2.4 鱼类Ⅰ型IFN的系统进化 | 第25-26页 |
| 1.5.3 鱼类Ⅱ型IFN | 第26-27页 |
| 1.5.4 鱼类IFN受体 | 第27-29页 |
| 1.5.4.1 鱼类Ⅰ型IFN受体 | 第27-28页 |
| 1.5.4.2 鱼类Ⅱ型IFN的受体 | 第28-29页 |
| 1.5.5 鱼类IFN的信号传递 | 第29-36页 |
| 1.5.5.1 鱼类IFN的Jak/Stat信号传递通路 | 第29-31页 |
| 1.5.5.2 鱼类IFN的TLR信号传递通路 | 第31-33页 |
| 1.5.5.3 鱼类IFN的RLR信号传递通路 | 第33-34页 |
| 1.5.5.4 鱼类IFN的IRF信号传递通路 | 第34-36页 |
| 1.5.6 鱼类IFN的生物活性 | 第36-38页 |
| 1.5.6.1 鱼类Ⅰ型IFN的生物活性 | 第36页 |
| 1.5.6.2 鱼类Ⅱ型IFN的生物活性 | 第36-38页 |
| 1.6 IFN的临床应用概况 | 第38页 |
| 1.7 国内外草鱼养殖现状 | 第38-40页 |
| 1.8 草鱼出血病病毒 | 第40页 |
| 1.9 本研究的目的和意义 | 第40-42页 |
| 1.9.1 本研究的目的 | 第40页 |
| 1.9.2 本研究的意义 | 第40-42页 |
| 第二章 材料和方法 | 第42-66页 |
| 2.1 仪器与试剂 | 第42-45页 |
| 2.1.1 主要仪器设备 | 第42-43页 |
| 2.1.2 主要试剂盒 | 第43页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第43-44页 |
| 2.1.4 载体和菌株 | 第44-45页 |
| 2.1.5 引物 | 第45页 |
| 2.1.6 相关生物软件 | 第45页 |
| 2.2 实验材料 | 第45-46页 |
| 2.3 实验方法 | 第46-66页 |
| 2.3.1 草鱼IFN基因的克隆 | 第46-50页 |
| 2.3.1.1 总RNA的提取 | 第46页 |
| 2.3.1.2 总RNA纯度与完整性的检测 | 第46-47页 |
| 2.3.1.3 第一链cDNA的制备 | 第47页 |
| 2.3.1.4 反转录效果的检测 | 第47-48页 |
| 2.3.1.5 草鱼IFN(CiIFN)基因的特异扩增 | 第48-49页 |
| 2.3.1.6 pMD18-T/CiIFN载体的构建 | 第49页 |
| 2.3.1.7 pET-32a(+)/CiIFN重组质粒的构建 | 第49-50页 |
| 2.3.2 重组草鱼干扰素(rCiIFN)的原核表达 | 第50-51页 |
| 2.3.2.1 rCiIFN原核表达的小量验证 | 第50页 |
| 2.3.2.2 rCiIFN原核表达最佳诱导时间的确定 | 第50-51页 |
| 2.3.2.3 rCiIFN的大量诱导 | 第51页 |
| 2.3.3 rCiIFN原核表达产物的纯化及其浓度测定 | 第51-53页 |
| 2.3.3.1 rCiIFN原核表达产物的纯化 | 第51-52页 |
| 2.3.3.2 rCiIFN蛋白质浓度的测定 | 第52-53页 |
| 2.3.4 rCiIFN兔多抗血清的制备及其性能鉴定 | 第53-56页 |
| 2.3.4.1 rCilFN兔多抗血清的制备 | 第53-54页 |
| 2.3.4.2 ELISA间接法测定多克隆抗体效价 | 第54-55页 |
| 2.3.4.3 Western blot测定多抗血清的特异性 | 第55-56页 |
| 2.3.5 rCiIFN的生物活性测定 | 第56-58页 |
| 2.3.5.1 CIK细胞复苏 | 第56页 |
| 2.3.5.2 CIK细胞培养及传代 | 第56-57页 |
| 2.3.5.3 CIK细胞株的保藏 | 第57页 |
| 2.3.5.4 rCiIFN的效价测定 | 第57-58页 |
| 2.3.6 rCilFN抗GCHV的免疫保护效果分析 | 第58-59页 |
| 2.3.6.1 rCiIFN对CIK细胞的保护 | 第58页 |
| 2.3.6.2 rCiIFN对草鱼的免疫保护 | 第58-59页 |
| 2.3.7 rCiIFN对草鱼ISG的诱导表达模式 | 第59-61页 |
| 2.3.7.1 草鱼各组织总RNA提取 | 第59-60页 |
| 2.3.7.2 CIK细胞总RNA的提取 | 第60页 |
| 2.3.7.3 实时荧光定量PCR分析 | 第60-61页 |
| 2.3.8 草鱼肠道不同区段对rCiIFN的吸收 | 第61-62页 |
| 2.3.8.1 草鱼的前期处理与rCiIFN填喂法 | 第61页 |
| 2.3.8.2 冰冻切片免疫组织化学分析 | 第61-62页 |
| 2.3.9 rCiIFN在草鱼体内的代谢 | 第62-64页 |
| 2.3.9.1 给药方法与草鱼血清制备 | 第62页 |
| 2.3.9.2 双抗夹心ELISA法测定实验 | 第62-63页 |
| 2.3.9.3 rCiIFN在草鱼体内的代谢过程 | 第63-64页 |
| 2.3.10 rCiIFN的应用可行性初步分析 | 第64-66页 |
| 2.3.10.1 rCiIFN包涵体的变性与复性 | 第64页 |
| 2.3.10.2 rCiIFN诱导表达的中试分析 | 第64页 |
| 2.3.10.3 颗粒饲料对rCiIFN的吸附及其溶解损失分析 | 第64-66页 |
| 第三章 实验结果 | 第66-84页 |
| 3.1 草鱼IFN基因的克隆 | 第66-68页 |
| 3.1.1 草鱼脾脏总RNA的提取 | 第66页 |
| 3.1.2 反转录效果的检测 | 第66页 |
| 3.1.3 草鱼IFN(CiIFN)基因的特异性扩增及其纯化 | 第66-67页 |
| 3.1.4 pMD18-T/CiIFN载体的构建 | 第67页 |
| 3.1.5 pET-32a(+)/CiIFN载体的构建 | 第67-68页 |
| 3.2 重组草鱼干扰素(rCiIFN)的原核表达纯化与鉴定 | 第68-71页 |
| 3.2.1 rCiIFN的原核表达 | 第68-69页 |
| 3.2.2 rCiIFN的纯化及其鉴定 | 第69页 |
| 3.2.4 rCiIFN蛋白质浓度的测定 | 第69-70页 |
| 3.2.5 rCiIFN多抗血清的效价测定 | 第70页 |
| 3.2.6 GCHV滴度和rCiIFN效价的测定 | 第70-71页 |
| 3.3 rCiIFN的免疫保护效果分析 | 第71-73页 |
| 3.3.1 rCiIFN对CIK细胞的免疫保护 | 第71页 |
| 3.3.2 rCiIFN对草鱼的免疫保护 | 第71-73页 |
| 3.4 rCiIFN对草鱼ISG的诱导表达模式分析 | 第73-78页 |
| 3.4.1 总RNA提取 | 第73-74页 |
| 3.4.2 实时荧光定量PCR分析 | 第74-78页 |
| 3.4.2.1 rCiIFN诱导CIK细胞Mx和IFN基因的表达 | 第74-75页 |
| 3.4.2.2 腹腔注射rCiIFN后诱导草鱼体内ISG的表达 | 第75-77页 |
| 3.4.2.3 口服rCiIFN诱导草鱼IFN基因的表达 | 第77-78页 |
| 3.5 草鱼肠道不同区段对rCiIFN的吸收 | 第78-79页 |
| 3.6 rCiIFN在草鱼体内的代谢过程 | 第79-81页 |
| 3.6.1 rCiIFN双抗夹心ELISA标准曲线 | 第79-80页 |
| 3.6.2 rCiIFN在草鱼体内的代谢过程 | 第80-81页 |
| 3.7 rCiIFN的应用可行性初步分析 | 第81-84页 |
| 3.7.1 rCiIFN包涵体的变性与复性 | 第81-82页 |
| 3.7.2 rCiIFN的中试分析 | 第82页 |
| 3.7.3 颗粒饲料对rCiIFN的吸附及其溶解损失程度 | 第82-84页 |
| 第四章 讨论 | 第84-97页 |
| 4.1 本研究中草鱼IFN的类型 | 第84-85页 |
| 4.2 鱼类水产养殖与疾病防控方法 | 第85-86页 |
| 4.3 鱼类重组IFN的生物活性 | 第86-88页 |
| 4.4 鱼类Ⅰ型IFN诱导ISG表达 | 第88-90页 |
| 4.5 IFN使用剂量与疾病防治效果 | 第90-92页 |
| 4.6 鱼类消化道的结构与吸收生物活性蛋白多肽的特点 | 第92-94页 |
| 4.7 rCiIFN在草鱼体内的代谢过程 | 第94-95页 |
| 4.8 rCiIFN口服免疫途径推广应用的可行性 | 第95页 |
| 4.9 下一阶段的研究工作 | 第95-97页 |
| 第五章 小结 | 第97-98页 |
| 参考文献 | 第98-109页 |
| 致谢 | 第109-110页 |
| 附录1 缩略语 | 第110-112页 |
| 附录2 论文列表 | 第112页 |
