| 摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 符号说明 | 第9-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-17页 |
| 1.1 肿瘤 | 第11页 |
| 1.2 Rap2b的研究概况 | 第11-13页 |
| 1.2.1 Rap2b的发现 | 第11-12页 |
| 1.2.2 Rap2b的功能 | 第12-13页 |
| 1.3 线粒体研究概况 | 第13-15页 |
| 1.3.1 线粒体在整个细胞中的作用 | 第13页 |
| 1.3.2 细胞凋亡 | 第13-14页 |
| 1.3.3 线粒体与细胞凋亡 | 第14页 |
| 1.3.4 线粒体上Bcl-2家族在细胞凋亡中的作用 | 第14-15页 |
| 1.4 研究的目的和意义 | 第15-17页 |
| 第二章 材料与方法 | 第17-41页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第17-19页 |
| 2.1.1 质粒、菌株和细胞株 | 第17页 |
| 2.1.2 主要实验材料 | 第17页 |
| 2.1.3 基本试剂配制 | 第17-19页 |
| 2.2 仪器与设备 | 第19-21页 |
| 2.3 技术路线 | 第21-22页 |
| 2.4 实验方法 | 第22-41页 |
| 2.4.1 引物设计 | 第22-24页 |
| 2.4.2 慢病毒重组质粒构建 | 第24-25页 |
| 2.4.3 复苏细胞并接种 | 第25-26页 |
| 2.4.4 慢病毒包装 | 第26页 |
| 2.4.5 慢病毒滴度检测 | 第26-27页 |
| 2.4.6 细胞株筛选以及冻存 | 第27页 |
| 2.4.7 SDS-PAGE凝胶配制及电泳 | 第27-28页 |
| 2.4.8 免疫印迹法检测细胞内目的基因的蛋白表达水平 | 第28-29页 |
| 2.4.9 RNA提取 | 第29页 |
| 2.4.10 逆转录合成cDNA | 第29-30页 |
| 2.4.11 实时荧光定量PCR法检测目的基因和相关基因mRNA表达水平 | 第30-31页 |
| 2.4.12 药物处理细胞并检测 | 第31页 |
| 2.4.13 提取线粒体检测相关基因表达水平变化 | 第31-32页 |
| 2.4.14 小鼠IgG纯化、浓缩及SDS-PAGE鉴定 | 第32-33页 |
| 2.4.15 免疫荧光实验 | 第33页 |
| 2.4.16 目的蛋白的大量诱导表达及小量纯化(GST-Rap2b) | 第33-34页 |
| 2.4.17 GST pulldown胞浆、线粒体总蛋白和银染实验 | 第34-35页 |
| 2.4.18 分析质谱分析结果 | 第35页 |
| 2.4.19 聚合酶链式反应 | 第35-36页 |
| 2.4.20 PCR产物纯化 | 第36页 |
| 2.4.21 表达重组载体构建 | 第36-37页 |
| 2.4.22 菌落PCR筛选阳性克隆 | 第37页 |
| 2.4.23 表达菌的建立 | 第37-38页 |
| 2.4.24 目的蛋白小量纯化(His-TrxA-HSPA9) | 第38-39页 |
| 2.4.25 目的蛋白大量表达及大量纯化(His-TrxA-HSPA9) | 第39页 |
| 2.4.26 GST-pulldown实验(蛋白) | 第39-40页 |
| 2.4.27 质粒转染细胞实验 | 第40-41页 |
| 第三章 结果与分析 | 第41-60页 |
| 3.1 Rap2b可控敲减细胞的建立及检测 | 第41-43页 |
| 3.1.1 慢病毒重组质粒的构建 | 第41页 |
| 3.1.2 慢病毒滴度测定 | 第41-42页 |
| 3.1.3 免疫印迹法检测Rap2b基因敲减效率 | 第42-43页 |
| 3.1.4 实时荧光定量PCR检测Rap2b基因敲减效率 | 第43页 |
| 3.2 Rap2b的敲减对细胞凋亡蛋白表达水平的影响 | 第43-47页 |
| 3.2.1 Rap2b的敲减对胞内相关基因mRNA和蛋白水平的影响 | 第43-44页 |
| 3.2.2 在药物胁迫下,Rap2b的敲减对胞内相关蛋白水平的影响 | 第44-45页 |
| 3.2.3 线粒体的提取 | 第45-46页 |
| 3.2.4 Rap2b的敲减对线粒体相关蛋白水平的影响 | 第46-47页 |
| 3.3 Rap2b在细胞内的定位 | 第47-49页 |
| 3.3.1 小鼠血清中IgG的纯化 | 第47-48页 |
| 3.3.2 免疫荧光实验检测Rap2b在细胞内的定位 | 第48-49页 |
| 3.4 Rap2b与胞浆线粒体蛋白之间的相互作用 | 第49-52页 |
| 3.4.1 Rap2b(m)融合蛋白的表达 | 第49-50页 |
| 3.4.2 GST-Rap2b与胞浆线粒体蛋白pulldown实验 | 第50-51页 |
| 3.4.3 质谱分析 | 第51页 |
| 3.4.4 GST-Rap2b与胞浆、线粒体蛋白pulldown后的产物进行免疫印迹法以验证特异相互作用的是否为HSPA9 | 第51-52页 |
| 3.5 Rap2b与HSPA9相互作用的体外鉴定 | 第52-56页 |
| 3.5.1 pET-32a-HSPA9基因克隆与重组质粒的构建 | 第52-53页 |
| 3.5.2 HSPA9融合蛋白的表达与纯化 | 第53-55页 |
| 3.5.3 体外GST-Rap2b pulldown His-TrxA-HSPA9实验 | 第55-56页 |
| 3.6 Rap2b与HSPA9体内相互作用鉴定 | 第56-60页 |
| 3.6.1 荧光双分子pBiFC-mCherry重组质粒的构建 | 第56-57页 |
| 3.6.2 pBiFC-mCherryN159-Rap2b(m)和pBiFC-mCherryC160-HSPA9重组质粒的构建 | 第57-58页 |
| 3.6.3 质粒转染细胞,Rap2b与HSPA9体内相互作用鉴定 | 第58-60页 |
| 第四章 讨论和总结 | 第60-66页 |
| 4.1 讨论 | 第60-65页 |
| 4.2 总结 | 第65-66页 |
| 参考文献 | 第66-69页 |
| 致谢 | 第69-70页 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 | 第70-71页 |
