| 英文缩略词 | 第8-10页 |
| 中文摘要 | 第10-13页 |
| 英文摘要 | 第13-16页 |
| 前言 | 第17-20页 |
| 第一部分 荧光共振能量转移(FRET)体系的构建及其验证 | 第20-42页 |
| 1.实验材料 | 第20-24页 |
| 1.1 质粒与菌株 | 第20页 |
| 1.2 工具酶及主要试剂 | 第20-22页 |
| 1.3 工程荧光蛋白纯化主要层析介质 | 第22页 |
| 1.4 主要一次性耗材 | 第22页 |
| 1.5 实验仪器 | 第22-24页 |
| 2.实验方法 | 第24-29页 |
| 2.1 DNA目的片段获取 | 第24-25页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第24页 |
| 2.1.2 常规PCR反应 | 第24-25页 |
| 2.2 工程质粒构建 | 第25-27页 |
| 2.2.1 N端CFP和N端YFP工程质粒的构建 | 第25页 |
| 2.2.2 C端CFP和C端YFP工程质粒的构建 | 第25-26页 |
| 2.2.3 N端CFP-C端YFP融合蛋白工程质粒的构建 | 第26页 |
| 2.2.4 N端YFP-C端CFP融合蛋白工程质粒的构建 | 第26页 |
| 2.2.5 阴性对照YFP-SA2-CFP融合蛋白工程质粒的构建 | 第26页 |
| 2.2.6 阴性对照YFP-CTCF-CFP融合蛋白工程质粒的构建 | 第26-27页 |
| 2.3 工程蛋白诱导表达与鉴定 | 第27页 |
| 2.4 工程荧光蛋白纯化与制备 | 第27-28页 |
| 2.5 酶标仪检测荧光共振能量转移(FRET) | 第28-29页 |
| 3.实验结果 | 第29-40页 |
| 3.1 增强型黄色荧光蛋白(EYFP) | 第29页 |
| 3.1.1 N端增强型黄色荧光蛋白(EYFP-N) | 第29页 |
| 3.1.2 C端增强型黄色荧光蛋白(EYFP-C) | 第29页 |
| 3.2 增强型青色荧光蛋白(ECFP) | 第29-31页 |
| 3.2.1 N端增强型青色荧光蛋白(ECFP-N) | 第29-30页 |
| 3.2.2 C端增强型青色荧光蛋白(ECFP-C) | 第30-31页 |
| 3.3 N端ECFP-C端EYFP融合蛋白(ECFP-EYFP) | 第31页 |
| 3.4 N端EYFP-C端ECFP融合蛋白(EYFP-ECFP) | 第31页 |
| 3.5 阴性对照YFP-SA2-CFP融合蛋白 | 第31-32页 |
| 3.6 阴性对照YFP-CTCF-CFP融合蛋白 | 第32-33页 |
| 3.7 荧光蛋白小量诱导表达与鉴定 | 第33-35页 |
| 3.8 荧光蛋白纯化与制备 | 第35-36页 |
| 3.9 酶标仪检测FRET的产生 | 第36-40页 |
| 3.9.1 蛋白条件下,酶标仪检测FRET信号 | 第36-38页 |
| 3.9.2 菌液条件下,酶标仪检测FRET信号 | 第38-40页 |
| 4.讨论与小结 | 第40-42页 |
| 4.1 讨论 | 第40-41页 |
| 4.2 小结 | 第41-42页 |
| 第二部分 AMPK与其底物蛋白SAMS相互作用的研究 | 第42-67页 |
| 1.实验材料 | 第42-45页 |
| 1.1 质粒与菌株 | 第42页 |
| 1.2 工具酶及主要试剂 | 第42-44页 |
| 1.3 工程蛋白纯化主要层析介质 | 第44页 |
| 1.4 主要一次性耗材 | 第44页 |
| 1.5 实验仪器 | 第44-45页 |
| 2.实验方法 | 第45-53页 |
| 2.1 引物设计 | 第45页 |
| 2.2 N端SAMS和C端CFP融合蛋白工程质粒的构建 | 第45-46页 |
| 2.3 工程质粒DNA突变 | 第46-47页 |
| 2.3.1 AMPKT_(172E)突变型工程质粒的构建 | 第46页 |
| 2.3.2 AMPKT_(172D)突变型工程质粒的构建 | 第46页 |
| 2.3.3 N端SAMA-C端CFP融合突变型工程质粒的构建 | 第46-47页 |
| 2.4 工程蛋白诱导表达与鉴定 | 第47页 |
| 2.5 工程蛋白纯化与制备 | 第47-49页 |
| 2.6 Native电泳检测蛋白-蛋白相互作用 | 第49-52页 |
| 2.6.1 不同摩尔比 | 第49-50页 |
| 2.6.2 不同PH | 第50页 |
| 2.6.3 不同盐浓度 | 第50-51页 |
| 2.6.4 加入AMPK直接激动剂A- | 第51页 |
| 2.6.5 加入AMPK激动剂AMP | 第51-52页 |
| 2.6.6 不同AMP/ATP比值 | 第52页 |
| 2.7 荧光偏振(FP)检测蛋白-蛋白相互作用 | 第52-53页 |
| 3.实验结果 | 第53-63页 |
| 3.1 工程蛋白的构建 | 第53-54页 |
| 3.1.1 SAMS多肽与C端ECFP融合蛋白(SAMS-ECFP) | 第53页 |
| 3.1.2 AMPKT_(172E)突变型工程蛋白 | 第53-54页 |
| 3.1.3 AMPKT_(172D)突变型工程蛋白 | 第54页 |
| 3.1.4 SAMA-ECFP突变型工程蛋白 | 第54页 |
| 3.2 工程蛋白小量诱导表达与鉴定 | 第54-55页 |
| 3.3 工程蛋白纯化与制备 | 第55-56页 |
| 3.4 Native电泳检测SAMS-ECFP蛋白与AMPK的结合 | 第56-61页 |
| 3.4.1 不同摩尔比 | 第56页 |
| 3.4.2 不同pH | 第56-57页 |
| 3.4.3 不同盐浓度 | 第57-58页 |
| 3.4.4 加入AMPK直接激动剂A- | 第58页 |
| 3.4.5 加入AMPK激动剂AMP | 第58-60页 |
| 3.4.6 不同AMP/ATP比值 | 第60-61页 |
| 3.5 FP检测SAMS-ECFP蛋白与AMPK的结合 | 第61-63页 |
| 4.讨论与小结 | 第63-66页 |
| 4.1 讨论 | 第63-65页 |
| 4.2 小结 | 第65-66页 |
| 5.全文总结 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-71页 |
| 附录 | 第71-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 综述 | 第74-86页 |
| 参考文献 | 第83-86页 |
