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荔枝采后主要病原菌的特性及内生细菌对其防治保鲜研究

摘要第14-17页
Abstract第17-19页
前言第20-34页
    1.1 荔枝主要采后病害种类第20-21页
    1.2 荔枝采后病害的防治研究概况第21-22页
    1.3 荔枝采后果实的保鲜研究概况第22-25页
        1.3.1 荔枝采后果实褐变机理第22-23页
        1.3.2 荔枝采后果实保鲜方法研究概况第23-25页
    1.4 植物内生细菌研究历史第25-26页
    1.5 植物内生细菌的内生定殖研究第26-28页
    1.6 植物内生细菌对果蔬采后病害的防治研究概况第28-29页
    1.7 植物内生细菌的防病机制研究概况第29-30页
    1.8 丝状真菌遗传转化研究进展第30-31页
        1.8.1 丝状真菌遗传转化方法的研究第30页
        1.8.2 PEG 介导转化第30页
        1.8.3 限制性内切酶介导的DNA 转化法第30-31页
        1.8.4 农杆菌介导的真菌转化法第31页
    1.9 绿色荧光蛋白研究进展第31-32页
    1.10 GFP 及其突变体在真菌中的应用第32-33页
        1.10.1 GFP 在真菌研究中的应用第32页
        1.10.2 GFP 与目的基因融合在真菌分子生物学研究中的应用第32-33页
    1.11 绿色荧光蛋白标记菌株的检测方法第33-34页
第一章 荔枝采后病原菌的分离及其生物学特性研究第34-64页
    1 材料与方法第34-39页
        1.1 供试植物材料:新鲜荔枝(由市场购买)第34页
        1.2 供试培养基第34页
        1.3 荔枝果实采后病害的病原菌的分离第34页
        1.4 荔枝霜疫霉的生物学特性第34-37页
            1.4.1 荔枝霜疫霉的形态特征观察第34-35页
            1.4.2 荔枝霜疫霉卵孢子的产生第35页
            1.4.3 荔枝霜疫霉生长最适的pH 值测定第35页
            1.4.4 荔枝霜疫霉生长最适的温度测定第35页
            1.4.5 荔枝霜疫霉产孢培养基的筛选第35页
            1.4.6 菌落直径与孢子囊数目的测量方法第35页
            1.4.7 光照时间对荔枝霜疫霉生长与产孢的测定第35页
            1.4.8 荔枝霜疫霉孢子囊萌发的形态特征第35-36页
            1.4.9 培养条件对荔枝霜疫霉孢子囊萌发的测定第36页
            1.4.10 荔枝霜疫霉孢子囊致死温度的测定第36-37页
            1.4.11 荔枝霜疫霉侵染的最适温度测定第37页
            1.4.12 荔枝霜疫霉侵染的最适荔枝成熟度的测定第37页
            1.4.13 荔枝霜疫霉的寄主范围测定第37页
            1.4.14 荔枝霜疫霉侵染的扫描电镜观察第37页
        1.5 荔枝酸腐菌的生物学特性研究第37-39页
            1.5.1 荔枝酸腐菌形态观察第37页
            1.5.2 pH 值对荔枝酸腐菌生长、产孢及孢子萌发的测定第37-38页
            1.5.3 温度对荔枝酸腐菌生长、产孢及孢子萌发的测定第38页
            1.5.4 光照时间对荔枝酸腐菌生长、产孢及孢子萌发的测定第38页
            1.5.5 培养基对荔枝酸腐菌生长、产孢及孢子萌发的测定第38页
            1.5.6 植物汁液(营养成分)对荔枝酸腐菌分生孢子萌发的测定第38页
            1.5.7 不同培养时间所产生的分生孢子对其萌发的测定第38页
            1.5.8 荔枝酸腐菌分生孢子致死温度的测定第38页
            1.5.9 菌落直径与分生孢子数目的测量方法第38页
            1.5.10 荔枝酸腐菌侵染的最适温度测定第38-39页
            1.5.11 不同培养时间的荔枝酸腐菌对荔枝侵染的测定第39页
            1.5.12 不同培养基上培养的荔枝酸腐菌对荔枝侵染的测定第39页
            1.5.13 荔枝酸腐菌的寄主范围测定第39页
    2 结果与分析第39-61页
        2.1 荔枝果实采后病害的病原菌分离第39页
        2.2 荔枝霜疫霉(P. litchii)的生物学特性观察第39-53页
            2.2.1 荔枝霜疫霉形态学特征第39-43页
            2.2.2 荔枝霜疫霉孢子囊致死温度的测定第43页
            2.2.3 荔枝霜疫霉生长与产孢的影响条件第43-47页
                2.2.3.1 pH 对荔枝霜疫霉生长与产孢的影响第43-44页
                2.2.3.2 温度对荔枝霜疫霉生长与产孢的影响第44-45页
                2.2.3.3 光照时间对荔枝霜疫霉生长与产孢的影响第45页
                2.2.3.4 培养基种类对荔枝霜疫霉生长与产孢的影响第45-47页
            2.2.4 荔枝霜疫霉孢子囊萌发的影响条件第47-49页
                2.2.4.1 不同培养基和不同的光照条件对荔枝霜疫霉孢子囊萌发影响第47页
                2.2.4.2 荔枝霜疫霉在不同培养时间下所产生的孢子囊的萌发情况第47页
                2.2.4.3 温度对荔枝霜疫霉孢子囊萌发影响第47页
                2.2.4.4 荔枝霜疫霉在不同培养基上培养所产生的孢子囊的萌发情况第47-48页
                2.2.4.5 光照时间对荔枝霜疫霉孢子囊萌发的影响第48页
                2.2.4.6 植物汁液(营养成分)对荔枝霜疫霉孢子囊萌发的影响第48页
                2.2.4.7 不同pH 的培养基上产生的孢子囊萌发情况第48-49页
            2.2.5 荔枝霜疫霉侵染的最适温度测定第49页
            2.2.6 荔枝霜疫霉侵染的最适荔枝成熟度的测定第49-50页
            2.2.7 荔枝霜疫霉的寄主范围测定第50页
            2.2.8 荔枝霜疫霉侵染的超微结构观察第50-53页
        2.3 荔枝酸腐菌的生物学特征第53-61页
            2.3.1 荔枝酸腐菌的形态学特征第53页
            2.3.2 荔枝酸腐菌生长与产孢条件的筛选第53-56页
                2.3.2.1 培养基对荔枝酸腐菌生长与产孢数的影响第53-54页
                2.3.2.2 pH 对荔枝酸腐菌生长与产孢的影响第54-55页
                2.3.2.3 温度对荔枝酸腐菌生长与产孢的影响第55页
                2.3.2.4 光照时间对荔枝酸腐菌生长与产孢的影响第55-56页
            2.3.3 荔枝酸腐菌分生孢子萌发及侵染条件试验第56-60页
                2.3.3.1 温度对荔枝酸腐菌分生孢子萌发与侵染的影响第56-57页
                2.3.3.2 荔枝酸腐菌在不同培养基上形成的分生孢子对其萌发与侵染的影响第57-58页
                2.3.3.3 不同培养时间所产生的分生孢子对其萌发与侵染的影响第58-59页
                2.3.3.4 pH 对荔枝酸腐菌分生孢子萌发的影响第59页
                2.3.3.5 光照时间对荔枝酸腐菌分生孢子萌发的影响第59页
                2.3.3.6 植物汁液对荔枝酸腐菌分生孢子萌发的影响第59-60页
            2.3.4 荔枝酸腐菌分生孢子致死温度的测定第60页
            2.3.5 荔枝酸腐菌寄主范围测定第60-61页
    3 小结与讨论第61-64页
第二章 荔枝霜疫霉及酸腐菌遗传转化体系的构建第64-99页
    2.1 实验材料第64-67页
        2.1.1 供试菌株与质粒第64页
        2.1.2 培养基第64-65页
        2.1.3 试剂第65-67页
            2.1.3.1 基本试剂第65-67页
            2.1.3.2 引物第67页
        2.1.4 主要仪器第67页
    2.2 实验方法第67-78页
        2.2.1 荔枝霜疫霉原生质体的制备第67-68页
            2.2.1.1 菌株的培养第67页
            2.2.1.2 原生质体制备步骤第67-68页
            2.2.1.3 细胞壁裂解酶及其组合对荔枝霜疫霉原生质体形成的测定第68页
            2.2.1.4 崩溃酶浓度对荔枝霜疫霉原生质体形成的测定第68页
            2.2.1.5 菌龄对荔枝霜疫霉的原生质体形成的测定第68页
            2.2.1.6 裂解温度对荔枝霜疫霉原生质体形成的测定第68页
            2.2.1.7 培养基对荔枝霜疫霉原生质体形成的测定第68页
            2.2.1.8 原生质体的观察第68页
        2.2.2 荔枝霜疫霉原生质体的再生第68-70页
            2.2.2.1 不同的崩溃酶浓度酶解所产生的原生质体再生的测定第68-69页
            2.2.2.2 不同酶解时间所产生的原生质体再生的测定第69页
            2.2.2.3 不同培养基上形成的菌丝酶解所产生的原生质体再生的测定第69页
            2.2.2.4 不同培养时间的菌丝酶解后所产生的原生质体再生的测定第69页
            2.2.2.5 再生培养基对荔枝霜疫霉原生质体再生的影响第69页
            2.2.2.6 渗透压及其浓度对荔枝霜疫霉原生质体再生的影响第69页
            2.2.2.7 原生质体再生率测定第69页
            2.2.2.8 原生质体再生菌株的生长速率和致病性测定第69-70页
        2.2.3 荔枝酸腐菌原生质体的制备第70页
        2.2.4 荔枝酸腐菌原生质体的再生第70页
        2.2.5 荔枝霜疫霉与酸腐菌潮霉素及新霉素敏感性测定第70页
        2.2.6 质粒DNA 提取第70页
        2.2.7 重组质粒pHAMT35G-EGFP 与pHSP-EGFP 的构建第70-77页
            2.2.7.1 目的片段的获得第70-71页
            2.2.7.2 目的片段的纯化与回收第71-73页
            2.2.7.3 目的片段与载体的连接第73-75页
            2.2.7.4 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化第75页
            2.2.7.5 重组质粒的鉴定第75-77页
                2.2.7.5.1 菌落PCR第76页
                2.2.7.5.2 质粒PCR第76页
                2.2.7.5.3 重组质粒的酶切验证第76-77页
        2.2.8 转化方法第77页
        2.2.9 转化子的分子检测第77-78页
            2.2.9.1 荔枝霜疫霉或荔枝酸腐菌DNA 的提取第77页
            2.2.9.2 PCR 扩增第77-78页
        2.2.10 转化子的荧光观察第78页
    2.3 结果与分析第78-96页
        2.3.1 荔枝霜疫霉菌原生质体的制备第78-81页
            2.3.1.1 不同种类的酶及酶组合对荔枝霜疫霉原生质体形成的影响第78页
            2.3.1.2 酶解时间对荔枝霜疫霉原生质体形成的影响第78-79页
            2.3.1.3 崩溃酶浓度对荔枝霜疫霉原生质体形成的影响第79页
            2.3.1.4 不同菌龄的荔枝霜疫霉对其原生质体形成的影响第79页
            2.3.1.5 不同培养基培养的荔枝霜疫霉菌丝对其原生质体形成的影响第79-80页
            2.3.1.6 酶解温度对荔枝霜疫霉原生质体形成的影响第80-81页
            2.3.1.7 原生质体的形成过程第81页
        2.3.2 荔枝霜疫霉原生质体的再生第81-85页
            2.3.2.1 不同崩溃酶浓度所产生的荔枝霜疫霉原生质体对其再生的影响第81-82页
            2.3.2.2 不同酶解时间对荔枝霜疫霉原生质体再生的影响第82页
            2.3.2.3 不同培养基培养的菌丝所产生的原生质体对其再生的影响第82-83页
            2.3.2.4 不同培养时间的荔枝霜疫霉所产生的原生质体对其再生的影响第83页
            2.3.2.5 不同培养基对荔枝霜疫霉原生质体再生的影响第83-84页
            2.3.2.6 不同渗透压浓度对荔枝霜疫霉原生质体再生的影响第84页
            2.3.2.7 原生质体再生菌株的生物学特性第84-85页
        2.3.3 荔枝霜疫霉GFP 基因的转化第85-90页
            2.3.3.1 荔枝霜疫霉抗生素浓度的筛选第85-86页
            2.3.3.2 荔枝霜疫霉表达载体的构建第86-90页
        2.3.4 荔枝酸腐菌原生质体的制备第90-93页
            2.3.4.1 荔枝酸腐菌原生质体的制备第90-93页
        2.3.5 荔枝酸腐菌原生质体的再生第93-94页
        2.3.6 原生质体再生菌株的生物学特性第94页
        2.3.7 荔枝酸腐菌GFP 工程菌的构建第94-95页
        2.3.8 转化子的显微镜观察第95页
        2.3.9 EGFP 转化子的分子检测第95-96页
        2.3.10 转化子的生物学特性第96页
    2.4 小结与讨论第96-99页
第三章 荔枝采后病害内生拮抗细菌的筛选第99-108页
    3.1 材料与方法第99-101页
        3.1.1 供试植物材料第99页
        3.1.2 供试菌株第99页
        3.1.3 供试培养基第99-100页
        3.1.4 供试植物第100页
        3.1.5 内生细菌分离方法第100页
        3.1.6 拮抗微生物的筛选第100-101页
            3.1.6.1 菌丝生长抑制法第100页
            3.1.6.2 孢子囊萌发抑制法第100-101页
        3.1.7 拮抗微生物对病菌菌丝的抑制观测第101页
        3.1.8 拮抗微生物对荔枝防病保鲜实验第101页
    3.2 结果与分析第101-106页
        3.2.1 拮抗微生物的分离与筛选第101-103页
        3.2.2 内生细菌对荔枝霜疫霉的抑制作用第103页
        3.2.3 内生细菌对荔枝霜疫霉菌丝的抑制作用第103-104页
        3.2.4 内生细菌对荔枝酸腐菌孢子的抑制作用第104页
        3.2.5 拮抗微生物对荔枝防病保鲜作用第104-106页
            3.2.5.1 常温下拮抗微生物对荔枝采后病害的防治及保鲜第104-106页
            3.2.5.2 4℃低温储藏下拮抗微生物对荔枝采后病害的防治及保鲜第106页
    3.3 小结与讨论第106-108页
第四章 内生拮抗细菌在荔枝体内的定殖研究第108-116页
    4.1 材料和方法第108-109页
        4.1.1 供试菌株第108页
        4.1.2 抗生素第108页
        4.1.3 内生细菌在荔枝体内的定殖动态测定第108页
        4.1.4 内生细菌在荔枝叶片与果皮的定殖位置测定第108-109页
    4.2 结果与分析第109-114页
        4.2.1 内生细菌在荔枝叶片的定殖动态第109-110页
        4.2.2 内生细菌在荔枝花上的定殖动态第110页
        4.2.3 内生细菌在荔枝幼果的定殖动态第110-111页
        4.2.4 内生细菌在荔枝成熟果实果皮的定殖动态第111页
        4.2.5 内生细菌在荔枝成熟果实果皮的定殖与防病的关系第111-112页
        4.2.6 荧光显微镜下观察内生细菌在荔枝叶片与果皮的定殖位置第112-114页
    4.3 小结与讨论第114-116页
第五章 内生细菌对荔枝采后病害的防治研究第116-146页
    5.1 材料与方法第116-122页
        5.1.1 供试菌株第116页
        5.1.2 培养基第116-117页
        5.1.3 供试品种第117页
        5.1.4 内生细菌对荔枝采后病害的防治第117-118页
            5.1.4.1 内生细菌对荔枝霜疫病的防治试验第117页
            5.1.4.2 不同浓度的内生细菌对荔枝霜疫病防病效果测定第117页
            5.1.4.3 菌株菌体和胞外分泌物对荔枝霜疫病与酸腐病的防病作用测定第117页
            5.1.4.4 植物内生细菌对荔枝酸腐病的防治试验第117-118页
        5.1.5 内生细菌对荔枝采后病害的防治机理研究第118-122页
            5.1.5.1 接种取样方法第118页
            5.1.5.2 荔枝果皮抗坏血酸(AsA)含量的测定第118页
            5.1.5.3 荔枝果皮活性氧代谢指标(MDA、O_2、POD、SOD、CAT)的测定第118-119页
            5.1.5.4 荔枝果皮多酚氧化酶(PPO)活性的测定第119页
            5.1.5.5 荔枝果皮苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定第119页
            5.1.5.6 荔枝果皮还原型谷胱甘肽(GSH)的测定第119-120页
            5.1.5.7 荔枝果皮膜透性测定第120页
            5.1.5.8 可溶性糖的测定-苯酚法第120页
            5.1.5.9 还原糖的测定-斐林试剂比色法第120-121页
            5.1.5.10 荔枝果皮β-1,3-葡聚糖酶活性的测定第121页
            5.1.5.11 荔枝果皮几丁质酶活性的测定第121-122页
            5.1.5.12 荔枝果皮纤维素酶活性的测定第122页
    5.2 结果与分析第122-143页
        5.2.1 不同浓度的内生细菌对荔枝霜疫病的防治效果第122页
        5.2.2 内生细菌的不同接种处理对荔枝霜疫病的防治效果第122-123页
        5.2.3 内生细菌不同接种时间对荔枝霜疫病的防病效果第123-124页
        5.2.4 内生细菌对荔枝霜疫病的防治研究第124-126页
        5.2.5 内生细菌对荔枝酸腐病的防治研究第126-127页
        5.2.6 内生细菌对荔枝采后病害的防治机理研究第127-143页
            5.2.6.1 内生细菌对荔枝果皮膜透性的影响第127-128页
            5.2.6.2 内生细菌对荔枝果皮丙二醛(MDA)含量的影响第128-129页
            5.2.6.3 内生细菌对荔枝果皮超氧化物岐化酶(SOD)活性的影响第129-130页
            5.2.6.4 内生细菌对荔枝果皮POD 活性的影响第130-132页
            5.2.6.5 内生细菌对荔枝果皮CAT 活性的影响第132-133页
            5.2.6.6 内生细菌对荔枝果皮超氧阴离子自由基产生速率(O_2)的影响第133-134页
            5.2.6.7 内生细菌对荔枝果皮PAL 酶活性的影响第134-135页
            5.2.6.8 内生细菌对荔枝果皮PPO 含量的影响第135-136页
            5.2.6.9 内生细菌对荔枝果皮ASA 含量的影响第136页
            5.2.6.10 内生细菌对荔枝果皮DASA 含量的影响第136-138页
            5.2.6.11 内生细菌对荔枝果皮GSH 含量的影响第138-139页
            5.2.6.12 内生细菌对荔枝果皮几丁质酶活性的影响第139-140页
            5.2.6.13 内生细菌对荔枝果皮β-1,3-葡聚糖酶活性的影响第140-141页
            5.2.6.14 内生细菌对荔枝果皮纤维素酶活性的影响第141-142页
            5.2.6.15 内生细菌对荔枝果皮可溶性糖含量的影响第142-143页
            5.2.6.16 内生细菌对荔枝果皮还原糖含量的影响第143页
    5.3 小结与讨论第143-146页
第六章 内生细菌对荔枝的保鲜作用研究第146-169页
    6.1 实验材料与方法第146-150页
        6.1.1 供试菌株第146页
        6.1.2 培养基第146页
        6.1.3 供试荔枝第146页
        6.1.4 内生细菌对荔枝的保鲜处理第146-147页
        6.1.5 菌株菌体和胞外泌物对荔枝采后果实的保鲜效果测定第147页
        6.1.6 果皮膜透性的测定第147页
        6.1.7 保护酶活性的测定第147页
        6.1.8 荔枝果皮抗坏血酸含量的测定第147页
        6.1.9 花色素苷的提取与测定第147页
        6.1.10 花色素苷酶活性的测定第147-148页
        6.1.11 果皮可溶性酚的测定第148页
        6.1.12 果皮PPO 活性测定第148页
        6.1.13 果皮可滴定酸及pH 的测定第148页
        6.1.14 果皮类黄酮的测定第148页
        6.1.15 可溶性糖的测定-苯酚法第148页
        6.1.16 还原糖的测定-斐林试剂比色法第148页
        6.2.17 荔枝果实游离有机酸含量的测定第148-149页
        6.1.18 Vc 测定-2,6 一二氯靛酚滴定法第149页
        6.1.19 荔枝果实还原糖的测定-3,5-二硝基水杨酸比色法第149-150页
        6.1.20 荔枝果实可溶性糖的测定-苯酚法第150页
        6.1.21 荔枝果肉氨基酸含量的测定第150页
    6.2 结果与分析第150-166页
        6.2.1 不同浓度的内生细菌对荔枝采后果实的保鲜效果第150-151页
        6.2.2 内生细菌对荔枝采后果实的保鲜效果第151-152页
        6.2.3 内生细菌对荔枝采后果实保鲜机理研究第152-166页
            6.2.3.1 内生细菌对荔枝果皮膜透性的影响第152-153页
            6.2.3.2 内生细菌对荔枝果皮丙二醛含量(MDA)含量的影响第153页
            6.2.3.3 内生细菌对荔枝果皮超氧离子自由基(O_2)产生速率的影响第153-154页
            6.2.3.4 内生细菌对荔枝果皮超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响第154-155页
            6.2.3.5 内生细菌对荔枝果皮过氧化氢氧化酶(CAT)活性的影响第155页
            6.2.3.6 内生细菌对荔枝果皮过氧化物酶(POD)活性的影响第155-156页
            6.2.3.7 内生细菌对荔枝果皮多酚氧化酶(PPO)活性的影响第156-157页
            6.2.3.8 内生细菌对荔枝果皮还原型抗坏血酸(ASA)与脱氢抗坏血酸(DASA)含量的影响第157-158页
            6.2.3.9 内生细菌对荔枝果皮花色素苷酶活性的影响第158页
            6.2.3.10 内生细菌对荔枝果皮花色苷含量的影响第158-160页
            6.2.3.11 内生细菌对荔枝果皮酚类含量的影响第160页
            6.2.3.12 内生细菌对荔枝果皮类黄酮含量的影响第160-161页
            6.2.3.13 内生细菌对荔枝果皮pH 值的影响第161-162页
            6.2.3.14 内生细菌对荔枝果皮可溶性糖含量的影响第162页
            6.2.3.15 内生细菌对荔枝果皮还原糖含量的影响第162-163页
            6.2.3.16 内生细菌对荔枝果肉营养成分的影响第163-166页
                6.2.3.16.1 内生细菌对荔枝果实可溶性糖含量的影响第163-164页
                6.2.3.16.2 内生细菌对荔枝果实还原糖含量的影响第164页
                6.2.3.16.3 内生细菌对荔枝果实游离有机酸含量的影响第164-165页
                6.2.3.16.4 内生细菌对荔枝果肉还原性Vc含量的影响第165-166页
                6.2.3.16.5 内生细菌对荔枝果实氨基酸含量的影响第166页
    6.3 小结与讨论第166-169页
总结第169-171页
参考文献第171-191页
附录:攻博期间发表(或投稿)论文及主持或参加课题第191-192页
致谢第192页

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