| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 1 前言 | 第14-22页 |
| 1.1 天然橡胶生产现状 | 第14-15页 |
| 1.2 抗逆基因的分类 | 第15-16页 |
| 1.3 海藻糖的研究进展 | 第16-19页 |
| 1.3.1 海藻糖的性质及其作用 | 第16-17页 |
| 1.3.2 海藻糖的生物合成途径 | 第17-18页 |
| 1.3.3 海藻糖的分解途径 | 第18-19页 |
| 1.4 6-磷酸海藻糖合成酶在植物转基因上的应用 | 第19-20页 |
| 1.5 本研究的目的与意义 | 第20-21页 |
| 1.6 本研究的技术路线 | 第21-22页 |
| 2 材料与方法 | 第22-48页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第22页 |
| 2.1.1 植物材料 | 第22页 |
| 2.1.2 质粒与菌种 | 第22页 |
| 2.1.3 工具酶及试剂 | 第22页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第22-48页 |
| 2.2.1 巴西橡胶树TPS基因克隆 | 第22-29页 |
| 2.2.1.1 巴西橡胶树RNA的提取 | 第22-24页 |
| 2.2.1.2 RNA电泳检测 | 第24页 |
| 2.2.1.3 RNA浓度的测定 | 第24页 |
| 2.2.1.4 RNA中DNA的消化 | 第24-25页 |
| 2.2.1.5 cDNA第一链合成 | 第25页 |
| 2.2.1.6 TPS基因EST组装后的序列(contig)获取 | 第25-26页 |
| 2.2.1.7 TPS基因5’RACE扩增 | 第26-28页 |
| 2.2.1.8 TPS基因3’RACE扩增 | 第28页 |
| 2.2.1.9 TPS基因cDNA全长扩增 | 第28-29页 |
| 2.2.2 HbTPS基因的实时荧光定量PCR表达分析 | 第29-31页 |
| 2.2.2.1 伤害处理后橡胶树胶乳的收集 | 第29-30页 |
| 2.2.2.2 未开割树胶乳的收集 | 第30页 |
| 2.2.2.3 巴西橡胶树不同组织材料的采集 | 第30页 |
| 2.2.2.4 健康树和不同程度死皮树胶乳的收集 | 第30页 |
| 2.2.2.5 1.5%乙烯利刺激橡胶树后胶乳的收集 | 第30页 |
| 2.2.2.6 赤霉素(GA)刺激橡胶树后胶乳的收集 | 第30页 |
| 2.2.2.7 生长素(2,4-D)刺激橡胶树后胶乳的收集 | 第30页 |
| 2.2.2.8 水杨酸(SA)刺激橡胶树后胶乳的收集 | 第30页 |
| 2.2.2.9 甲基茉莉酸(JA)刺激橡胶树后胶乳的收集 | 第30页 |
| 2.2.2.10 脱落酸(ABA)刺激橡胶树后胶乳的收集 | 第30页 |
| 2.2.2.11 非生物胁迫处理后橡胶树幼苗不同组织的采集 | 第30-31页 |
| 2.2.3 HbTPS1、HbTPS2基因的启动子克隆 | 第31-34页 |
| 2.2.3.1 引物设计 | 第31页 |
| 2.2.3.2 从Genome Walker文库中进行PCR-based DNA Walking | 第31-33页 |
| 2.2.3.3 PCR产物的回收、连接及重组质粒的鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.3.4 DNA的序列测定 | 第34页 |
| 2.2.4 HbTPS1、HbTPS2基因组织原位杂交 | 第34-40页 |
| 2.2.4.1 样品处理与包埋 | 第34-35页 |
| 2.2.4.2 组织原位杂交探针的制备 | 第35-38页 |
| 2.2.4.3 预杂交 | 第38页 |
| 2.2.4.4 杂交及清洗 | 第38-39页 |
| 2.2.4.5 显色反应 | 第39-40页 |
| 2.2.4.6 荧光显微镜观察和拍照 | 第40页 |
| 2.2.5 HbTPS1、Hb7PS2基因酵母互补实验 | 第40-43页 |
| 2.2.5.1 酵母TPS基因突变株的制备 | 第40-41页 |
| 2.2.5.2 酵母功能互补载体的构建 | 第41-42页 |
| 2.2.5.3 酵母功能互补实验 | 第42-43页 |
| 2.2.6 HbTPS1、HbTPS2基因转拟南芥的研究 | 第43-48页 |
| 2.2.6.1 HbTPS1、HbTPS2转基因载体构建 | 第43-45页 |
| 2.2.6.2 重组载体转化拟南芥 | 第45页 |
| 2.2.6.3 转基因拟南芥阳性纯系植株的筛选 | 第45-47页 |
| 2.2.6.4 拟南芥胁迫处理 | 第47-48页 |
| 3 结果与分析 | 第48-72页 |
| 3.1 橡胶树不同组织RNA的提取及检测 | 第48页 |
| 3.2 HbTPS基因全长cDNA的克隆和序列分析 | 第48-54页 |
| 3.2.1 HbTPS基因EST组装序列的获得 | 第48页 |
| 3.2.2 HbTPS基因5’端序列的扩增 | 第48-49页 |
| 3.2.3 HbTPS基因3’端序列的扩增 | 第49-50页 |
| 3.2.4 HbTPS基因cDNA全长序列的获得 | 第50-51页 |
| 3.2.5 HbTPS基因的生物信息学分析 | 第51-54页 |
| 3.2.5.1 HbTPS1和HbTPS2基因的亚细胞定位预测 | 第51页 |
| 3.2.5.2 蛋白质亲疏水性质和跨膜结构域分析 | 第51-52页 |
| 3.2.5.3 序列比对与系统进化 | 第52-54页 |
| 3.3 HbTPS基因的表达分析 | 第54-59页 |
| 3.3.1 不同组织中HbTPS基因表达的差异比较 | 第54-55页 |
| 3.3.2 割胶对HbTPS基因表达的影响 | 第55页 |
| 3.3.3 伤害处理对HbTPS基因表达的影响 | 第55页 |
| 3.3.4 健康树和不同程度死皮树(TPD)中HbTPS基因表达差异分析 | 第55-56页 |
| 3.3.5 不同激素刺激对HbTPS基因表达的影响 | 第56-57页 |
| 3.3.5.1 乙烯利(ET)刺激对HbTPS基因表达的影响 | 第56页 |
| 3.3.5.2 甲基茉莉酸(MeJA)刺激对HbTPS基因表达的影响 | 第56页 |
| 3.3.5.3 脱落酸(ABA)刺激对HbTPS基因表达的影响 | 第56-57页 |
| 3.3.5.4 生长素(2,4-D)刺激对HbTPS基因表达的影响 | 第57页 |
| 3.3.5.5 赤霉素(GA)刺激对HbTPS基因表达的影响 | 第57页 |
| 3.3.5.6 水杨酸(SA)刺激对HbTPS基因表达的影响 | 第57页 |
| 3.3.6 非生物胁迫对HbTPS基因表达的影响 | 第57-59页 |
| 3.3.6.1 低温胁迫对HbTPS基因表达的影响 | 第57-58页 |
| 3.3.6.2 高温胁迫对HbTPS基因表达的影响 | 第58页 |
| 3.3.6.3 干旱胁迫对HbTPS基因表达的影响 | 第58-59页 |
| 3.4 HbTPS基因启动子克隆与序列分析 | 第59-62页 |
| 3.4.1 HbTPS基因启动子序列克隆 | 第59-60页 |
| 3.4.2 HbTPS基因的启动子序列分析 | 第60-62页 |
| 3.5 HbTPS基因组织原位杂交分析 | 第62-65页 |
| 3.5.1 HbTPS基因探针片段扩增 | 第62页 |
| 3.5.2 RNA探针的制备 | 第62-63页 |
| 3.5.3 两种组织原位杂交 | 第63-65页 |
| 3.6 HbTPS基因酵母互补实验 | 第65-67页 |
| 3.6.1 酵母TPS基因突变株的制备 | 第65-66页 |
| 3.6.2 HbTPS基因酵母互补载体的构建 | 第66页 |
| 3.6.3 HbTPS基因酵母功能互补实验 | 第66-67页 |
| 3.7 HbTPS基因转拟南芥的研究 | 第67-72页 |
| 3.7.1 HbTPS转基因载体的构建 | 第67-68页 |
| 3.7.2 转基因拟南芥阳性植株的鉴定 | 第68-70页 |
| 3.7.3 转基因拟南芥表型变化 | 第70页 |
| 3.7.4 拟南芥胁迫处理 | 第70-72页 |
| 4 讨论 | 第72-75页 |
| 4.1 HbTPS1和HbTPS2基因的表达分析 | 第72页 |
| 4.2 HbTPS1和HbTPS2基因的结构功能分析 | 第72-73页 |
| 4.3 HbTPS1和HbTPS2基因的生理功能探讨 | 第73页 |
| 4.4 HbTPS基因的进一步研究 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-81页 |
| 作者在读期间科研成果简介 | 第81-82页 |
| 附录 | 第82-86页 |
| 附录一：有关试剂的配制 | 第82-84页 |
| 附录二：缩略词 | 第84-86页 |
| 致谢 | 第86页 |
