| 导师评阅表 | 第4-6页 |
| 摘要 | 第6-7页 |
| 英文摘要 | 第7-8页 |
| 英文缩略词表 | 第12-13页 |
| 前言 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-24页 |
| 1.1 布鲁氏菌简介 | 第14-18页 |
| 1.1.1 布鲁氏菌的历史 | 第14页 |
| 1.1.2 布鲁氏菌-非典型致病基因病原体 | 第14-15页 |
| 1.1.3 布鲁氏菌的生物特性 | 第15页 |
| 1.1.4 布鲁氏菌胞内寄生 | 第15-16页 |
| 1.1.5 布鲁氏菌M5 | 第16页 |
| 1.1.6 布鲁氏菌16M | 第16页 |
| 1.1.7 布鲁氏菌的发病机制 | 第16-17页 |
| 1.1.8 人畜共患传染病 | 第17页 |
| 1.1.9 布鲁氏菌病 | 第17-18页 |
| 1.2 绿色荧光表达蛋白(GFP)---报告基因 | 第18-20页 |
| 1.2.1 流式细胞仪在细胞生物学中的应用研究 | 第19页 |
| 1.2.2 流式细胞仪的工作原理 | 第19-20页 |
| 1.2.3 流式细胞仪在生物实验中的应用 | 第20页 |
| 1.3 激光扫描共聚焦显微镜与细胞生物学应用的研究进展 | 第20-23页 |
| 1.3.1 激光共聚焦显微镜在生物学中的应用 | 第21-22页 |
| 1.3.2 荧光的定位、定量分析 | 第22-23页 |
| 1.4 本研究的意义及技术路线 | 第23-24页 |
| 1.4.1 研究目的和意义 | 第23页 |
| 1.4.2 技术路线 | 第23-24页 |
| 第二章 整合重组GFP基因布鲁氏菌的获得及其检验与分析 | 第24-36页 |
| 2.1 材料仪器 | 第24-25页 |
| 2.1.1 材料 | 第24页 |
| 2.1.2 主要仪器 | 第24-25页 |
| 2.2 方法 | 第25-29页 |
| 2.2.1 pMC-221载体的转化 | 第25页 |
| 2.2.2 pMC-221载体的PCR鉴定 | 第25-26页 |
| 2.2.3 阳性菌的扩繁 | 第26页 |
| 2.2.4 pMC-221转化进入大肠杆菌的质粒提取 | 第26页 |
| 2.2.5 pMC-221载体的酶切鉴定 | 第26页 |
| 2.2.6 羊种布鲁氏菌16M和M5的培养 | 第26-27页 |
| 2.2.7 羊种布鲁氏菌16M和M5电转化感受态细胞的制备 | 第27页 |
| 2.2.8 电转化 | 第27页 |
| 2.2.9 GFP-布鲁氏菌16M和M5的培养 | 第27-28页 |
| 2.2.10 巨噬细胞系RAW264.7培养和细胞计数弃上清 | 第28页 |
| 2.2.11 GFP-布鲁氏菌16M和M5侵染巨噬细胞 | 第28页 |
| 2.2.12 GFP-布鲁氏菌16M和M5与布鲁氏菌16M和M5的胞内存活实验 | 第28-29页 |
| 2.2.13 布鲁氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬细胞的激光共聚焦显微镜试验 | 第29页 |
| 2.3 结果 | 第29-36页 |
| 2.3.1 含有pMC-221载体的DH5a和未含有pMC-221载体的DH5a菌株在氯霉素抗性LB固体培养基上的筛选结果 | 第29-30页 |
| 2.3.2 扩增GFPuv基因鉴定pMC-221载体 | 第30页 |
| 2.3.3 酶切鉴定pMC-221载体 | 第30-31页 |
| 2.3.4 pMC-22 1载体分析 | 第31-32页 |
| 2.3.5 布鲁氏菌16M和M5侵染之前小鼠巨噬细胞和菌量的计数结果 | 第32-33页 |
| 2.3.6 绿色荧光蛋白(GFP)表达结果 | 第33页 |
| 2.3.7 布鲁氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬细胞的激光共聚焦显微镜试验结果 | 第33-34页 |
| 2.3.8 16M和M5侵染小鼠巨噬细胞的胞内生存能力实验结果 | 第34-36页 |
| 第三章 整合重组GFP-布鲁氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬细胞与溶酶体、内质网和高尔基体的结合测定 | 第36-48页 |
| 3.1 材料仪器 | 第36页 |
| 3.1.1 实验材料 | 第36页 |
| 3.1.2 主要试剂盒及仪器 | 第36页 |
| 3.2 方法 | 第36-40页 |
| 3.2.1 PBS缓冲液和细胞培养液的配置 | 第36-37页 |
| 3.2.2 小鼠巨噬细胞RAW 264.7的培养 | 第37-38页 |
| 3.2.3 GFP-布鲁氏菌16M和M5的培养 | 第38页 |
| 3.2.4 GFP-布鲁氏菌16M和M5侵染巨噬细胞 | 第38页 |
| 3.2.5 激光共聚焦实验相关试剂的配制及对溶酶体、内质网和高尔基体的荧光标记 | 第38-40页 |
| 3.2.6 激光共聚焦显微镜观察检测小鼠巨噬细胞内布鲁氏菌16M和M5与溶酶体、内质网、高尔基体的结合 | 第40页 |
| 3.2.7 小鼠巨噬细胞内布鲁氏菌与溶酶体、内质网、高尔基体结合形成阳性内含物的荧光强度计算 | 第40页 |
| 3.3 结果 | 第40-48页 |
| 3.3.1 GFP-布鲁氏菌16M和M5的筛选 | 第40-41页 |
| 3.3.2 GFP-布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞1h的激光共聚焦显微镜观察结果 | 第41-42页 |
| 3.3.3 GFP-布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞1.5h的激光共聚焦显微镜观察结果 | 第42-44页 |
| 3.3.4 GFP-布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞2h的激光共聚焦显微镜观察结果 | 第44-45页 |
| 3.3.5 GFP-布鲁氏菌侵染小鼠巨噬细胞2.5h的激光共聚焦显微镜观察结果 | 第45-48页 |
| 第四章 整合重组GFP-布鲁氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬细胞与溶酶体、内质网和高尔基体初次结合的测定 | 第48-54页 |
| 4.1 材料仪器 | 第48页 |
| 4.1.1 材料 | 第48页 |
| 4.1.2 主要仪器 | 第48页 |
| 4.2 方法 | 第48-49页 |
| 4.2.1 布鲁氏菌的培养 | 第48页 |
| 4.2.2 小鼠巨噬细胞的培养 | 第48页 |
| 4.2.3 GFP-布鲁氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬细胞 | 第48-49页 |
| 4.2.4 GFP-布鲁氏菌16M和M5的胞内存活实验 | 第49页 |
| 4.2.5 荧光染料标记小鼠巨噬细胞内的溶酶体、内质网和高尔基体 | 第49页 |
| 4.2.6 GFP.小鼠巨噬细胞的收集 | 第49页 |
| 4.3 结果 | 第49-54页 |
| 4.3.1 GFP~+小鼠巨噬细胞5-25min的流式检测结果 | 第49-50页 |
| 4.3.2 GFP~+小鼠巨噬细胞0-6h的流式检测结果 | 第50页 |
| 4.3.3 GFP~+小鼠巨噬细胞0-48h的流式检测和胞内存活实验结果 | 第50-52页 |
| 4.3.4 布鲁氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬细胞10min的细胞分布图 | 第52页 |
| 4.3.5 布鲁氏菌16M和M5侵染小鼠巨噬细胞与胞内溶酶体、内质网、高尔基体结合的细胞分布图 | 第52-54页 |
| 第五章 讨论 | 第54-56页 |
| 5.1 pMC-221中GFP基因启动子 | 第54页 |
| 5.2 pMC-221载体的特点 | 第54页 |
| 5.3 电转化效率的优化 | 第54页 |
| 5.4 GFP-布鲁氏菌16M和M5与宿主细胞之间的相互作用 | 第54-55页 |
| 5.5 GFP-布鲁氏菌16M和M5的基因组学 | 第55-56页 |
| 第六章 结论 | 第56-57页 |
| 参考文献 | 第57-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 作者简介及在学成果 | 第63页 |
