| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 符号说明 | 第10-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-27页 |
| 一、猪源产肠毒素大肠杆菌致病机制研究进展 | 第11-14页 |
| 1.1 肠毒素 | 第11-12页 |
| 1.1.1 热敏肠毒素(LT) | 第11-12页 |
| 1.1.2 耐热肠毒素(ST) | 第12页 |
| 1.2 黏附素 | 第12-14页 |
| 1.2.1 Ⅰ型菌毛 | 第12-13页 |
| 1.2.2 共生菌毛 | 第13页 |
| 1.2.3 K88菌毛 | 第13-14页 |
| 1.3 鞭毛 | 第14页 |
| 1.4 其他潜在毒力因子 | 第14页 |
| 二、细菌非编码小RNA伴侣蛋白Hfq研究进展 | 第14-20页 |
| 2.1 sRNA伴侣蛋白Hfq的发现 | 第15页 |
| 2.2 伴侣蛋白Hfq分子结构及特性 | 第15-16页 |
| 2.3 伴侣蛋白Hfq参与细菌表型变化 | 第16-17页 |
| 2.4 伴侣蛋白Hfq对细菌致病性的影响 | 第17-18页 |
| 2.5 伴侣蛋白Hfq参与调控的分子机制 | 第18-19页 |
| 2.5.1 依赖于非编码的sRNA的转录后调控 | 第18页 |
| 2.5.2 不依赖于sRNA的转录后调控 | 第18页 |
| 2.5.3 伴侣蛋白Hfq自身表达活性的调控 | 第18-19页 |
| 2.6 总结与展望 | 第19-20页 |
| 参考文献 | 第20-27页 |
| 第二章 试验研究 | 第27-67页 |
| 研究一 K88ac~+产肠毒素大肠杆菌sRNA伴侣蛋白Hfq毒力相关功能研究 | 第27-51页 |
| 1 材料 | 第29-30页 |
| 1.1 菌株、质粒及抗体 | 第29页 |
| 1.2 培养基和主要试剂 | 第29页 |
| 1.3 主要仪器 | 第29-30页 |
| 1.4 试验动物 | 第30页 |
| 2 方法 | 第30-41页 |
| 2.1 产肠毒素大肠杆菌hfq基因缺失突变株C83902△hfq的构建 | 第30-33页 |
| 2.1.1 PCR引物设计 | 第30页 |
| 2.1.2 携带氯霉素抗性的融合PCR产物的制备与纯化 | 第30-31页 |
| 2.1.3 C83902电转化感受态细胞的制备及质粒pKD46的电转化 | 第31页 |
| 2.1.4 一次同源重组菌C83902△hfq::cat的构建 | 第31-32页 |
| 2.1.5 一次同源重组菌C83902△hfq::cat的PCR鉴定 | 第32页 |
| 2.1.6 质粒pKD46的消除 | 第32-33页 |
| 2.1.7 FLP位点专一性重组 | 第33页 |
| 2.1.8 第二次重组菌C83902△hfq鉴定及pCP20质粒的消除 | 第33页 |
| 2.2 回补株C83902△hfq/phfq的构建 | 第33-35页 |
| 2.2.1 回补质粒的构建 | 第33-35页 |
| 2.2.2 回补株的构建 | 第35页 |
| 2.3 qRT-PCR试验 | 第35-38页 |
| 2.3.1 毒力基因引物设计 | 第35-36页 |
| 2.3.2 细菌总RNA提取 | 第36-37页 |
| 2.3.3 基因组DNA的除去和总RNA的反转录 | 第37页 |
| 2.3.4 qRT-PCR反应 | 第37-38页 |
| 2.4 EcpA多克隆抗体的制备 | 第38-40页 |
| 2.4.1 EcpA蛋白原核表达引物的设计及原核表达载体构建 | 第38页 |
| 2.4.2 EcpA在pET-28a(+)载体中的原核表达 | 第38-39页 |
| 2.4.3 动物免疫 | 第39页 |
| 2.4.4 间接ELISA测定血清效价 | 第39-40页 |
| 2.4.5 EcpA重组蛋白鼠源多抗血清的制备 | 第40页 |
| 2.5 Western blot检测 | 第40-41页 |
| 2.5.1 样品制备 | 第40页 |
| 2.5.2 Western blot试验 | 第40-41页 |
| 3 结果 | 第41-48页 |
| 3.1 含氯霉素片段融合PCR产物的制备 | 第41-42页 |
| 3.2 一次重组菌C83902△hfq::cat的鉴定 | 第42-43页 |
| 3.3 C83902△hfq缺失突变株的鉴定 | 第43页 |
| 3.4 回补质粒的鉴定 | 第43-44页 |
| 3.5 hfq基因缺失对C83902毒力相关基因表达的影响 | 第44-45页 |
| 3.6 重组质粒pET28a(+)-ecpA的双酶切鉴定 | 第45-46页 |
| 3.7 EcpA蛋白诱导表达及纯化 | 第46-47页 |
| 3.8 Western blot检测hfq基因缺失对细菌毒力蛋白表达的影响 | 第47-48页 |
| 4 分析与讨论 | 第48-50页 |
| 4.1 在转录水平上 | 第49页 |
| 4.2 在蛋白表达水平上 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-51页 |
| 研究二 K88ac~+产肠毒素大肠杆菌sRNA伴侣蛋白Hfq致病相关性的研究 | 第51-67页 |
| 1 材料 | 第52-53页 |
| 1.1 相关菌株及细胞系 | 第52页 |
| 1.2 培养基和主要试剂 | 第52-53页 |
| 1.3 主要仪器 | 第53页 |
| 1.4 试验动物 | 第53页 |
| 2 方法 | 第53-57页 |
| 2.1 生长试验 | 第53页 |
| 2.2 生物被膜形成试验 | 第53-54页 |
| 2.2.1 生物被膜的定性试验 | 第53-54页 |
| 2.2.2 生物被膜的定量试验 | 第54页 |
| 2.3 IPEC-J2细胞黏附实验 | 第54-55页 |
| 2.3.1 IPEC-J2细胞的培养和传代 | 第54页 |
| 2.3.2 IPEC-J2细胞黏附实验 | 第54-55页 |
| 2.4 小鼠攻毒试验 | 第55-57页 |
| 2.4.1 相关菌株准备 | 第55页 |
| 2.4.2 细菌的复壮 | 第55页 |
| 2.4.3 预实验确定接种浓度 | 第55-56页 |
| 2.4.4 攻毒实验前小鼠准备 | 第56页 |
| 2.4.5 实验方案 | 第56-57页 |
| 3 结果 | 第57-62页 |
| 3.1 Hfq对C83902生长的影响 | 第57-58页 |
| 3.2 Hfq对C83902生物被膜形成的影响 | 第58-59页 |
| 3.2.1 生物被膜定性试验 | 第58-59页 |
| 3.2.2 生物被膜定量试验 | 第59页 |
| 3.3 IPEC-J2细胞黏附试验 | 第59-60页 |
| 3.4 小鼠攻毒试验结果 | 第60-62页 |
| 3.4.1 预实验接种浓度及细菌的培养与计数 | 第60-61页 |
| 3.4.2 临床变化与解剖 | 第61页 |
| 3.4.3 小鼠的剖检 | 第61-62页 |
| 4 分析与讨论 | 第62-65页 |
| 4.1 Hfq对C83902生长速率的影响 | 第63页 |
| 4.2 Hfq对C83902形成生物被膜能力的调控 | 第63-64页 |
| 4.3 Hfq对C83902黏附IPEC-J2细胞能力的影响 | 第64页 |
| 4.4 Hfq对C83902在小鼠肠道定殖作用的影响 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-67页 |
| 全文小结 | 第67-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 攻读硕士期间参与发表的学术论文 | 第69-70页 |
