| 摘要 | 第1-10页 |
| ABSTRACT | 第10-12页 |
| 缩略词表 | 第12-13页 |
| 第—篇 文献综述 | 第13-25页 |
| 第—章 丙酮酸脱氢酶研究进展 | 第13-19页 |
| ·丙酮酸脱氢酶的概述 | 第13页 |
| ·丙酮酸脱氢酶的结构 | 第13-15页 |
| ·丙酮酸脱氢酶复合体的催化机理 | 第15-16页 |
| ·丙酮酸脱氢酶的功能 | 第16-18页 |
| ·研究鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的意义 | 第18-19页 |
| 第二章 支原体基因工程研究工具 | 第19-25页 |
| ·转座子 | 第19-20页 |
| ·目的基因的敲除 | 第20-21页 |
| ·报告基因 | 第21-22页 |
| ·鸡毒支原体随机插入突变的研究意义 | 第22-25页 |
| 第二篇 丙酮酸脱氢酶的生物学功能研究 | 第25-57页 |
| 第三章 丙酮酸脱氢酶E1和E2亚基的原核表达及多抗制备 | 第25-35页 |
| 1 材料和方法 | 第25-29页 |
| ·菌种、载体、抗体及动物 | 第25页 |
| ·仪器 | 第25-26页 |
| ·试剂 | 第26页 |
| ·鸡毒支原体Rlow株基因组的提取 | 第26页 |
| ·pdha和pdhb基因的overlap PCR扩增 | 第26-27页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第27-28页 |
| ·目的基因的原核表达和蛋白纯化 | 第28页 |
| ·多克隆抗体的制备及免疫原性的分析 | 第28-29页 |
| 2 结果 | 第29-33页 |
| ·Overlap PCR扩增目的基因 | 第29-30页 |
| ·重组表达载体的构建 | 第30-31页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及纯化 | 第31-32页 |
| ·多抗的鉴定 | 第32-33页 |
| 3 讨论 | 第33-35页 |
| 第四章 鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶的酶活性研究 | 第35-43页 |
| 1 材料和方法 | 第35-38页 |
| ·仪器 | 第35页 |
| ·试剂 | 第35-36页 |
| ·二氯吲哚酚法测定丙酮酸脱氢酶活性 | 第36页 |
| ·标准曲线测定 | 第36-37页 |
| ·DCPIP的稳定性 | 第37页 |
| ·His-PDHA和His-PDHB的相对比活性测定 | 第37页 |
| ·不同DCPIP浓度对反应速率的影响 | 第37页 |
| ·pH对His-PDH活性影响 | 第37页 |
| ·温度对His-PDH活性的影响 | 第37-38页 |
| ·金属离子对His-PDH活性的影响 | 第38页 |
| 2 结果 | 第38-42页 |
| ·DCPIP标准曲线的制作 | 第38页 |
| ·DCPIP稳定性试验 | 第38-39页 |
| ·His-PDH的比活力测定 | 第39-40页 |
| ·米氏常数的测定 | 第40页 |
| ·温度对His-PDH酶活性的影响 | 第40-41页 |
| ·pH值对His-PDH的影响 | 第41页 |
| ·金属离子对反应的影响 | 第41-42页 |
| 3 讨论 | 第42-43页 |
| 第五章 鸡毒支原体丙酮酸脱氢酶E1和E2亚基的亚细胞定位及其生物学特性研究 | 第43-57页 |
| 1 材料与方法 | 第43-47页 |
| ·菌株、细胞株和载体 | 第43页 |
| ·仪器 | 第43页 |
| ·试剂 | 第43-44页 |
| ·鸡毒支原体膜蛋白的提取 | 第44页 |
| ·Western-blot试验 | 第44页 |
| ·间接免疫荧光试验 | 第44页 |
| ·纤连蛋白结合试验 | 第44页 |
| ·配体结合试验 | 第44-45页 |
| ·黏附及其黏附抑制试验 | 第45页 |
| ·膜表面展示载体的构建和表达 | 第45-46页 |
| ·重组菌对DF-1细胞的黏附和黏附抑制试验 | 第46-47页 |
| ·多抗血清体外杀菌试验 | 第47页 |
| 2 结果 | 第47-54页 |
| ·Western-blot检测 | 第47-48页 |
| ·悬浮法免疫荧光检测 | 第48页 |
| ·纤连蛋白结合试验 | 第48-49页 |
| ·配体结合试验 | 第49页 |
| ·鸡毒支原体黏附细胞及其黏附抑制试验 | 第49-50页 |
| ·膜表面展示载体的构建和表达 | 第50-51页 |
| ·PDHA和PDHB介导的大肠杆菌黏附DF1细胞 | 第51-54页 |
| ·His-PDHA和His-PDHB多抗血清的体外杀菌实验 | 第54页 |
| 3 讨论 | 第54-57页 |
| 第三篇 随机缺失转座载体的构建 | 第57-73页 |
| 第六章 鸡毒支原体随机缺失转座载体的构建 | 第57-73页 |
| 1 材料与方法 | 第57-63页 |
| ·菌株与载体 | 第57页 |
| ·仪器 | 第57页 |
| ·试剂 | 第57-58页 |
| ·药敏试验 | 第58页 |
| ·mini-Tn4001SpGm转座子的构建策略 | 第58-60页 |
| ·mini-Tn4001SpGm载体的构建 | 第60页 |
| ·随机转座载体电转化 | 第60-61页 |
| ·随机突变株筛选方法 | 第61页 |
| ·突变株的Southern杂交鉴定 | 第61-62页 |
| ·插入位置的确认 | 第62-63页 |
| 2 结果 | 第63-69页 |
| ·药敏试验 | 第63页 |
| ·液体药敏试验 | 第63-65页 |
| ·随机缺失转座载体的构建 | 第65页 |
| ·随机缺失转座载体的构建 | 第65-67页 |
| ·重组子筛选鉴定结果 | 第67-69页 |
| 4 讨论 | 第69-73页 |
| 参考文献 | 第73-83页 |
| 全文总结 | 第83-85页 |
| 致谢 | 第85-87页 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 | 第87页 |
