| 本论文的创新性工作 | 第1-4页 |
| 中文摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-9页 |
| 缩略词表 | 第9-17页 |
| 第一部分 文献综述及选题目的和意义 | 第17-22页 |
| 第一章 疱疹病毒UL16基因及其编码蛋白的研究进展 | 第17-22页 |
| 1. 疱疹病毒UL16基因及其编码蛋白的研究进展 | 第17-21页 |
| ·疱疹病毒UL16基因序列的特点 | 第17页 |
| ·疱疹病毒UL16基因编码蛋白氨基酸序列的特点 | 第17-18页 |
| ·疱疹病毒UL16基因编码蛋白的定位 | 第18页 |
| ·疱疹病毒UL16基因编码蛋白质的功能 | 第18-20页 |
| ·UL16蛋白与衣壳的相互作用 | 第18-19页 |
| ·UL16蛋白参与病毒粒子的成熟与出芽 | 第19-20页 |
| ·UL16蛋白与其他蛋白的相互作用 | 第20页 |
| ·展望 | 第20-21页 |
| 2. 选题的目的和意义 | 第21-22页 |
| 第二部分 试验研究 | 第22-88页 |
| 第二章 鸭瘟病毒UL16基因特性预测与分析 | 第22-38页 |
| 1. 材料与方法 | 第22-23页 |
| ·材料 | 第22页 |
| ·基因序列 | 第22页 |
| ·生物信息学分析工具 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-23页 |
| ·DPV UL16基因核酸序列预测分析 | 第22-23页 |
| ·DPV UL16蛋白质氨基酸序列分析 | 第23页 |
| ·DPV UL16基因密码子偏嗜性分析 | 第23页 |
| 2. 结果 | 第23-35页 |
| ·DPV UL16基因核酸预测分析 | 第23-24页 |
| ·DPV UL16蛋白质氨基酸序列分析 | 第24-30页 |
| ·蛋白质氨基酸序列分析 | 第24页 |
| ·蛋白质保守结构域分析 | 第24-25页 |
| ·蛋白质相性搜索及进化树的构建 | 第25-27页 |
| ·DPV UL16蛋白质结构预测分析 | 第27-28页 |
| ·蛋白质功能位点预测 | 第28-30页 |
| ·蛋白质亚细胞定位 | 第30页 |
| ·蛋白质抗原表位预测 | 第30页 |
| ·DPV UL16基因遗传密码子的偏嗜性分析 | 第30-35页 |
| 3. 讨论 | 第35-38页 |
| ·生物信息学 | 第35-36页 |
| ·DPV UL16基因及编码蛋白质特征 | 第36-37页 |
| ·DPV UL16基因遗传密码子的偏嗜性分析 | 第37-38页 |
| 第三章 鸭瘟病毒UL16基因克隆、原核表达及多克隆抗体的制备 | 第38-61页 |
| 1. 实验材料 | 第38-41页 |
| ·菌株、毒株及载体 | 第38页 |
| ·实验动物 | 第38页 |
| ·主要试剂 | 第38-39页 |
| ·主要溶液的配制 | 第39-41页 |
| ·DEFs培养液的配制 | 第39页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳液的配制 | 第39页 |
| ·SDS-PAGE电泳液的配制 | 第39-40页 |
| ·细菌培养液的配制 | 第40页 |
| ·Ni~(2+)柱亲和层析纯化带His标签的重组蛋白包涵体溶液 | 第40-41页 |
| ·弗氏佐剂的配制 | 第41页 |
| ·Western-blot溶液的配制 | 第41页 |
| ·主要实验仪器 | 第41页 |
| 2. 实验方法 | 第41-50页 |
| ·DPV基因组DNA的提取 | 第41-43页 |
| ·DEFs的培养 | 第41-42页 |
| ·DPV接种DEFs | 第42页 |
| ·DPV基因组DNA的提取 | 第42-43页 |
| ·DPV UL16基因的扩增 | 第43页 |
| ·PCR引物设计 | 第43页 |
| ·DPV UL16基因的PCR扩增 | 第43页 |
| ·DPV UL16基因PCR产物电泳 | 第43页 |
| ·DPVUL16基因T克隆与鉴定 | 第43-44页 |
| ·UL16基因T克隆 | 第43页 |
| ·T克隆pMD18-T-UL16质粒的鉴定 | 第43-44页 |
| ·pMD18-T-UL16质粒的提取 | 第43-44页 |
| ·pMD18-T-UL16质粒的鉴定 | 第44页 |
| ·构建DPV UL16基因重组表达载体 | 第44-46页 |
| ·pMD18-T-UL16和pET-32b(+)质粒的提取和双酶切 | 第44页 |
| ·凝胶回收酶切目的片段 | 第44页 |
| ·UL16基因重组表达质粒的构建 | 第44-45页 |
| ·DH5α和Rossetta(DE3)感受态细胞的制备 | 第45页 |
| ·重组pET32b(+)-UL16表达质粒转化至DH5α感受态细胞 | 第45页 |
| ·阳性菌落的筛选和鉴定 | 第45页 |
| ·构建重组蛋白表达菌株 | 第45-46页 |
| ·重组DPV UL16蛋白的诱导表达及条件优化 | 第46页 |
| ·重组UL16蛋白的诱导表达 | 第46页 |
| ·重组DPV UL16蛋白表达条件的优化 | 第46页 |
| ·IPTG诱导浓度的优化 | 第46页 |
| ·诱导时间的优化 | 第46页 |
| ·诱导温度的优化 | 第46页 |
| ·DPV UL16重组蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| ·UL16重组蛋白包涵体的洗涤 | 第46-47页 |
| ·UL16重组蛋白的Ni~(2+)柱亲和层析纯化 | 第47页 |
| ·UL16重组蛋白的复性 | 第47页 |
| ·DPV UL16重组蛋白免疫原性和反应原性检测 | 第47-48页 |
| ·兔抗DPV UL16重组蛋白多克隆抗体的制备 | 第48-49页 |
| ·免疫疫苗的制备 | 第48页 |
| ·免疫程序 | 第48-49页 |
| ·琼脂糖凝胶扩散试验测定制备的抗体的效价 | 第49页 |
| ·多克隆抗体特异性检测 | 第49页 |
| ·兔抗DPV UL16 IgG的纯化 | 第49-50页 |
| ·兔抗DPV UL16 IgG粗提纯 | 第49页 |
| ·High-Q阴离子交换层析纯化粗提的兔抗DPV UL16 IgG | 第49-50页 |
| 3. 结果 | 第50-58页 |
| ·DPV UL16基因PCR扩增和T-克隆鉴定 | 第50-51页 |
| ·重组表达质粒pET-32b(+)-UL16的构建和鉴定 | 第51页 |
| ·DPV UL16重组蛋白的表达及条件优化 | 第51-56页 |
| ·重组UL16蛋白的诱导表达 | 第51-52页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第52-53页 |
| ·诱导时间的优化 | 第53-54页 |
| ·诱导温度的优化 | 第54-55页 |
| ·重组UL16蛋白的纯化 | 第55-56页 |
| ·DPV UL16重组蛋白免疫原性和反应原性检测 | 第56-57页 |
| ·兔抗UL16多克隆抗体效价的测定 | 第57页 |
| ·兔抗DPV UL16多克隆抗体的Western-blot特异性检测 | 第57页 |
| ·兔抗DPV UL16 IgG的纯化及鉴定 | 第57-58页 |
| 4. 讨论 | 第58-61页 |
| ·UL16基因的原核表达 | 第58-59页 |
| ·多克隆抗体的制备及纯化 | 第59-61页 |
| 第四章 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞UL16基因转录 #45及表达时相分析 | 第61-73页 |
| 1. 材料 | 第61-62页 |
| ·毒株/细胞 | 第61页 |
| ·主要试剂 | 第61页 |
| ·主要实验设备 | 第61-62页 |
| ·实验器材处理 | 第62页 |
| 2. 实验方法 | 第62-65页 |
| ·FQ-PCR检测DPV体外感染DEFs UL16基因的转录实相 | 第62-64页 |
| ·DEFs的培养及DPV接种 | 第62页 |
| ·总RNA的抽提 | 第62页 |
| ·RNA反转录成cDNA | 第62-63页 |
| ·FQ-PCR引物的设计与合成 | 第63页 |
| ·标准样品的制备 | 第63页 |
| ·FQ-PCR引物的特异性检测 | 第63页 |
| ·FQ-PCR标准曲线的制作 | 第63页 |
| ·样品的定量检测 | 第63-64页 |
| ·FQ-PCR结果数据分析 | 第64页 |
| ·鸭瘟病毒体外感染DEFs UL16基因的表达实相分析 | 第64-65页 |
| ·DEFs的培养及DPV接种 | 第64页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第64页 |
| ·Western-blot分析UL16蛋白表达实相 | 第64-65页 |
| ·DNA合成抑制试验分析UL16基因类型 | 第65页 |
| ·DEFs的培养及RNA制备 | 第65页 |
| ·PCR检测UL16基因的转录 | 第65页 |
| 3. 结果 | 第65-70页 |
| ·提取RNA的完整性和纯度测定 | 第65页 |
| ·引物特异性检测 | 第65-66页 |
| ·FQ-PCR标准曲线的制作 | 第66-68页 |
| ·UL16基因FQ-PCR标准曲线的制作 | 第66-67页 |
| ·β-actin基因FQ-PCR标准曲线的制作 | 第67-68页 |
| ·DPV体外感染DEFs后UL16基因转录实相分析 | 第68-69页 |
| ·DPV体外感染DEFs UL16基因表达实相分析 | 第69页 |
| ·DNA合成抑制剂对DPV UL16基因转录影响分析 | 第69-70页 |
| 4. 讨论 | 第70-73页 |
| ·DPV感染DEFs后UL16基因转录和表达实相分析 | 第70-71页 |
| ·DNA合成抑制试验分析UL16基因的类型 | 第71-73页 |
| 第五章 鸭瘟病毒体外感染DEFs UL16基因产物的亚细胞定位 | 第73-79页 |
| 1. 材料 | 第73页 |
| ·病毒及细胞 | 第73页 |
| ·主要试剂 | 第73页 |
| ·主要仪器设备 | 第73页 |
| 2. 实验方法 | 第73-74页 |
| ·IFA法检测DPV UL16蛋白亚细胞定位方法的建立 | 第73-74页 |
| ·IFA法检测DPV UL16蛋白亚细胞定位方法的优化 | 第74页 |
| ·结果判断 | 第74页 |
| ·DPV UL16蛋白在DEFs中亚细胞定位的动态监测 | 第74页 |
| 3. 结果 | 第74-77页 |
| ·IFA法检测DPV UL16蛋白亚细胞定位方法的建立及条件优化 | 第74-75页 |
| ·DPV UL16蛋白在DEFs中亚细胞定位的动态监测 | 第75-77页 |
| 4. 讨论 | 第77-79页 |
| 第六章 基于重组DPV UL16蛋白的间接ELISA法检测鸭瘟病毒抗体 | 第79-88页 |
| 1. 实验材料 | 第79-80页 |
| ·UL16蛋白及血清 | 第79页 |
| ·主要仪器、试剂及其配制 | 第79-80页 |
| 2. 实验方法 | 第80-81页 |
| ·DPV UL16-ELISA法检测DPV抗体方法的建立 | 第80-81页 |
| ·抗原最佳包被浓度和血清稀释度的确定 | 第80页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第80页 |
| ·UL16-ELISA阴阳性临界值的确定 | 第80页 |
| ·UL16-ELISA敏感性实验 | 第80-81页 |
| ·UL16-ELISA重复性实验 | 第81页 |
| ·UL16-ELISA特异性实验 | 第81页 |
| ·UL16-ELISA阻断实验 | 第81页 |
| ·UL16-ELISA与SNT之间符合率实验 | 第81页 |
| 3. 结果 | 第81-85页 |
| ·DPV UL16-ELISA法检测DPV抗体方法的建立 | 第81-85页 |
| ·最佳抗原包被浓度和血清稀释度的优化 | 第81-82页 |
| ·酶标二抗最佳稀释度的确定 | 第82-83页 |
| ·UL16-ELISA阴阳性临界值的确定 | 第83页 |
| ·UL16-ELISA敏感性实验 | 第83页 |
| ·UL16-ELISA重复性实验 | 第83-84页 |
| ·UL16-ELISA特异性实验 | 第84页 |
| ·UL16-ELISA阻断实验 | 第84-85页 |
| ·UL16-ELISA与SNT之间符合率试验 | 第85页 |
| 4. 讨论 | 第85-88页 |
| 第三部分 结论 | 第88-89页 |
| 参考文献 | 第89-94页 |
| 致谢 | 第94-95页 |
| 作者简介以及攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第95页 |
