| 摘要 | 第1-11页 |
| Abstract | 第11-13页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-23页 |
| 1 前言 | 第13页 |
| 2 miRNAs的发现及命名 | 第13-14页 |
| ·miRNAs的发现 | 第13-14页 |
| ·miRNAs的命名 | 第14页 |
| 3 miRNAs的特点 | 第14-15页 |
| ·miRNAs的结构特点 | 第14页 |
| ·miRNAs的生物学特性 | 第14-15页 |
| 4 miRNAs的形成及调控机制 | 第15-17页 |
| ·miRNAs的形成 | 第15页 |
| ·miRNAs的调控机制 | 第15-17页 |
| 5 miRNAs的研究方法与检测技术 | 第17-19页 |
| ·正向遗传学筛选 | 第17页 |
| ·定向克隆 | 第17-19页 |
| ·组织特异性克隆 | 第17-18页 |
| ·miRNAs芯片 | 第18页 |
| ·Solexa测序 | 第18-19页 |
| ·生物信息学方法 | 第19页 |
| 6 miRNAs在动物繁殖方面的研究现状 | 第19-21页 |
| 7 猪miRNAs的研究现状 | 第21页 |
| 8 目的与意义 | 第21-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-34页 |
| 1 实验材料 | 第23-26页 |
| ·实验样品 | 第23页 |
| ·组织样品 | 第23页 |
| ·载体、菌株和细胞系 | 第23页 |
| ·主要仪器和设备 | 第23-24页 |
| ·主要试剂及试剂盒 | 第24页 |
| ·常用试剂及其配制 | 第24-25页 |
| ·主要生物信息学网站和分析软件 | 第25-26页 |
| 2 试验方法 | 第26-34页 |
| ·miRNAs芯片合成 | 第26页 |
| ·总RNA的提取及反转录获得cDNA第一链 | 第26-27页 |
| ·猪睾丸组织总RNA的提取 | 第26页 |
| ·猪睾丸组织总RNA浓度的测定和质量检测 | 第26-27页 |
| ·cDNA的制备 | 第27页 |
| ·cDNA的检测 | 第27页 |
| ·差异表达miRNA的验证 | 第27-30页 |
| ·cDNA的制备 | 第27-28页 |
| ·miRNA成熟序列扩增引物设计 | 第28页 |
| ·miRNA成熟序列的扩增 | 第28页 |
| ·miRNA成熟序列的克隆鉴定 | 第28页 |
| ·实时定量PCR验证miRNAs芯片中的差异表达miRNA | 第28-29页 |
| ·数据分析 | 第29-30页 |
| ·miRNA靶基因搜索 | 第30-31页 |
| ·靶基因实时定量PCR引物设计与合成 | 第30-31页 |
| ·靶基因的PCR扩增 | 第31页 |
| ·利用实时定量PCR对靶基因进行表达谱分析 | 第31页 |
| ·数据分析 | 第31页 |
| ·miRNA表达载体和双荧光素酶报告载体的构建 | 第31-33页 |
| ·插入片段的扩增 | 第31-32页 |
| ·载体的连接、测序及序列分析 | 第32页 |
| ·质粒的抽提及酶切鉴定 | 第32-33页 |
| ·细胞的培养 | 第33页 |
| ·miRNA表达载体转染猪睾丸细胞及转染后miRNA表达水平的检测 | 第33页 |
| ·双荧光素酶报告载体与miRNA表达载体共转染猪睾丸细胞 | 第33页 |
| ·双荧光素酶相对活性测定与分析 | 第33-34页 |
| 第三章 结果与分析 | 第34-48页 |
| 1 猪睾丸组织总RNA的提取与质量检测及cDNA检测结果 | 第34-35页 |
| ·总RNA浓度测定 | 第34页 |
| ·总RNA质量检测结果 | 第34页 |
| ·cDNA检测结果 | 第34-35页 |
| 2 猪睾丸组织总RNA加尾处理及加尾后cDNA检测结果 | 第35-36页 |
| ·加尾处理后RNA的质量检测结果 | 第35页 |
| ·加尾处理后cDNA检测结果 | 第35-36页 |
| 3 miRNAs芯片筛选性成熟前后差异表达的miRNA | 第36-37页 |
| 4 差异表达miRNA的实时定量PCR验证 | 第37-40页 |
| ·PCR扩增结果 | 第37页 |
| ·实时定量PCR | 第37-40页 |
| 5 靶基因预测及其在睾丸组织不同发育时期的表达分析 | 第40-45页 |
| ·靶基因预测 | 第40-43页 |
| ·靶基因PCR扩增结果 | 第43页 |
| ·靶基因的实时定量PCR | 第43-45页 |
| 6 miRNA表达载体和双荧光素酶报告载体的构建与鉴定 | 第45-48页 |
| ·插入片段的PCR扩增 | 第45页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第45-46页 |
| ·实时定量PCR检测转染后miRNA表达水平 | 第46页 |
| ·双荧光素酶活性检测 | 第46-48页 |
| 第四章 讨论 | 第48-55页 |
| 1 关于差异表达miRNA | 第48-49页 |
| ·关于miRNAs基因的预测方法 | 第48页 |
| ·关于差异表达miRNA的获得 | 第48-49页 |
| 2 关于靶基因的预测 | 第49页 |
| 3 关于本实验靶基因的验证 | 第49-52页 |
| ·关于AQN-1基因 | 第50页 |
| ·关于DAZL基因 | 第50-51页 |
| ·关于HAS3基因 | 第51页 |
| ·关于RNF4基因 | 第51页 |
| ·关于SMCP基因 | 第51页 |
| ·关于SPAG1基因 | 第51-52页 |
| ·关于SPAM-1基因 | 第52页 |
| 4 关于实时定量PCR | 第52-53页 |
| 5 关于载体的构建 | 第53页 |
| 6 关于miRNAs与靶基因相互作用关系的鉴定 | 第53-54页 |
| 7 不足之处和下一步工作计划 | 第54-55页 |
| 小结 | 第55-56页 |
| 参考文献 | 第56-63页 |
| 致谢 | 第63-64页 |
| 附录 | 第64-82页 |
