| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 英文缩写 | 第8-9页 |
| 第一章 文献综述 | 第9-22页 |
| 1．1 水解酶 | 第9-13页 |
| 1．1．1 酯酶 | 第9-10页 |
| 1．1．2 脂肪酶 | 第10-13页 |
| 1．2 脂肪酶应用于手性药物的拆分实例 | 第13-16页 |
| 1．2．1 抗菌药 | 第13页 |
| 1．2．2 牛肝酯酶催化紫杉醇侧链手性合成 | 第13-14页 |
| 1．2．3 手性胺的制备 | 第14页 |
| 1．2．4 环氧丙醇类药物中间体的拆分 | 第14-16页 |
| 1．3 2-芳基丙酸类药物的手性拆分 | 第16-18页 |
| 1．3．1 2-芳基丙酸类药物的概述 | 第16页 |
| 1．3．2 2-芳基丙酸类外消旋化合物的生物技术拆分 | 第16-17页 |
| 1．3．3 提高产物产率及或对映异构体纯度的方法 | 第17-18页 |
| 1．4 蛋白质工程 | 第18-20页 |
| 1．4．1 表达单一的异构酶 | 第18-19页 |
| 1．4．2 理性的蛋白质设计 | 第19页 |
| 1．4．3 体外定向进化 | 第19-20页 |
| 1．5 本课题的立体依据和研究内容 | 第20-22页 |
| 1．5．1 立题依据 | 第20-21页 |
| 1．5．2 研究内容 | 第21-22页 |
| 第二章 脂肪酶BSL编码基因的克隆与表达 | 第22-42页 |
| 2．1 实验材料 | 第22-23页 |
| 2．1．1 菌株 | 第22页 |
| 2．1．2 质粒载体 | 第22页 |
| 2．1．3 培养基 | 第22页 |
| 2．1．4 工具酶及试剂盒 | 第22-23页 |
| 2．1．5 主要试剂 | 第23页 |
| 2．1．6 主要仪器 | 第23页 |
| 2．2 实验方法 | 第23-30页 |
| 2．2．1 BACILLUS SP.基因组DNA的制备 | 第23-24页 |
| 2．2．2 PCR扩增目的基因 | 第24-25页 |
| 2．2．3 克隆载体的构建与转化 | 第25-26页 |
| 2．2．4 重组表达质粒PQE-30-BSL的构建与转化 | 第26-27页 |
| 2．2．5 阳性克隆的鉴定 | 第27页 |
| 2．2．6 重组表达质粒PET22B(+)-BSL的构建与转化 | 第27-28页 |
| 2．2．7 阳性克隆的鉴定 | 第28页 |
| 2．2．8 诱导表达 | 第28页 |
| 2．2．9 表达产物SDS-PAGE分析 | 第28页 |
| 2．2．10 表达产物的可溶性分析 | 第28页 |
| 2．2．11 诱导温度对表达的影响 | 第28页 |
| 2．2．12 诱导剂IPTG浓度对表达的影响 | 第28-29页 |
| 2．2．13 工程菌高密度培养的初步研究 | 第29页 |
| 2．2．14 外消旋氟比洛芬乙酯的合成 | 第29页 |
| 2．2．15 酯酶BSL活力测定 | 第29页 |
| 2．2．16 氟比洛芬含量和产物对映体过量值的测定 | 第29-30页 |
| 2．3 结果与分析 | 第30-40页 |
| 2．3．1 基因组DNA的获得 | 第30页 |
| 2．3．2 PCR扩增目的基因 | 第30-31页 |
| 2．3．3 重组子M15／PQE-30-BSL的鉴定 | 第31-33页 |
| 2．3．4 酶切方法鉴定 | 第33页 |
| 2．3．5 测序鉴定 | 第33页 |
| 2．3．6 重组子BL21／PET22B(+)-BSL的鉴定 | 第33-34页 |
| 2．3．7 酯酶BSL的蛋白质序列分析 | 第34-35页 |
| 2．3．8 重组质粒的诱导表达 | 第35-36页 |
| 2．3．9 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第36-37页 |
| 2．3．10 诱导温度对表达的影响 | 第37页 |
| 2．3．11 诱导剂IPTG浓度对表达的影响 | 第37-38页 |
| 2．3．12 工程菌的高密度培养研究 | 第38-40页 |
| 2．4 讨论 | 第40-42页 |
| 第三章 脂肪酶BSL的分离纯化及酶学性质研究 | 第42-53页 |
| 3．1 实验材料 | 第42页 |
| 3．1．1 主要试剂 | 第42页 |
| 3．1．2 主要溶液与缓冲液 | 第42页 |
| 3．1．3 实验菌株： | 第42页 |
| 3．1．4 主要仪器 | 第42页 |
| 3．2 实验方法 | 第42-44页 |
| 3．2．1 蛋白质浓度测定 | 第42-43页 |
| 3．2．2 BSL脂肪酶活力测定 | 第43页 |
| 3．2．3 HISTRAP FF 1ML亲和层析柱纯化脂肪酶BSL | 第43页 |
| 3．2．4 BSL脂肪酶的酶学性质研究 | 第43-44页 |
| 3．2．5 氟比洛芬含量测定 | 第44页 |
| 3．3 结果与分析 | 第44-51页 |
| 3．3．1 脂肪酶的分离纯化 | 第44-46页 |
| 3．3．2 脂肪酶的酶学性质研究 | 第46-51页 |
| 3．4 讨论 | 第51-53页 |
| 第四章 脂肪酶BSL催化拆分外消旋氟比洛芬的研究 | 第53-61页 |
| 4．1 实验材料 | 第53页 |
| 4．1．1 主要试剂 | 第53页 |
| 4．1．2 主要仪器 | 第53页 |
| 4．2 实验方法 | 第53-54页 |
| 4．2．1 底物浓度对拆分反应的影响 | 第53页 |
| 4．2．2 表面活性剂浓度对酶活的影响 | 第53页 |
| 4．2．3 小量制备光学纯(R)-氟比洛芬 | 第53页 |
| 4．2．4 产物(R)-氟比洛芬的分离提取 | 第53-54页 |
| 4．2．5 氟比洛芬含量和产物对映体过量值的测定 | 第54页 |
| 4．3 结果与分析 | 第54-59页 |
| 4．3．1 底物浓度对拆分反应的影响 | 第54页 |
| 4．3．2 表面活性剂浓度对酶活的影响 | 第54-55页 |
| 4．3．3 小量制备光学纯(R)-氟比洛芬 | 第55-59页 |
| 4．4 讨论 | 第59页 |
| 4．5 课题展望 | 第59-61页 |
| 第五章 结论 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 硕士学位期间发表的论文及申请的专利 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
