| 中文摘要 | 第1-12页 |
| 英文摘要 | 第12-15页 |
| 前言 | 第15-17页 |
| 文献综述 | 第17-44页 |
| 1 牛结核病的危害 | 第17页 |
| 2 流行病学 | 第17-19页 |
| 3 牛分枝杆菌的基因分型研究 | 第19-20页 |
| 4 结核分枝杆菌的致病机理 | 第20-23页 |
| 5 结核分枝杆菌的免疫机理 | 第23-25页 |
| 6 牛结核病的诊断 | 第25-27页 |
| 7 牛分枝杆菌分子生物学研究 | 第27-37页 |
| 8 牛结核病疫苗的研究 | 第37-44页 |
| 第一部分 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因的克隆及序列分析 | 第44-55页 |
| 1 引言 | 第44-45页 |
| 2 材料与方法 | 第45-49页 |
| ·材料 | 第45-47页 |
| ·菌株 | 第45页 |
| ·克隆载体 | 第45页 |
| ·工具酶 | 第45页 |
| ·核酸分子量标准 | 第45页 |
| ·试剂盒 | 第45页 |
| ·试剂 | 第45页 |
| ·溶液 | 第45-46页 |
| ·主要仪器设备 | 第46-47页 |
| ·方法 | 第47-49页 |
| ·牛分枝杆菌的培养 | 第47页 |
| ·染色体基因组DNA的提取 | 第47页 |
| ·引物的设计与合成 | 第47-48页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第48页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第48页 |
| ·目的基因与质粒载体的连接 | 第48-49页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第49页 |
| ·连接产物的转化 | 第49页 |
| ·质粒的小量提取 | 第49页 |
| ·重组质粒的鉴定 | 第49页 |
| ·重组质粒的序列测定 | 第49页 |
| 3 结果 | 第49-52页 |
| ·牛分枝杆菌染色体基因组DNA | 第49页 |
| ·目的基因的PCR扩增产物 | 第49-50页 |
| ·重组克隆的筛选及鉴定 | 第50-51页 |
| ·目的基因的序列测定与分析 | 第51-52页 |
| 4 讨论 | 第52-54页 |
| ·目的基因的来源 | 第52-53页 |
| ·目的基因的选择 | 第53-54页 |
| ·目的基因的序列分析 | 第54页 |
| 5 小结 | 第54-55页 |
| 第二部分 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因在大肠杆菌中的表达 | 第55-70页 |
| 1 引言 | 第55页 |
| 2 材料与方法 | 第55-60页 |
| ·材料 | 第55-58页 |
| ·菌株 | 第55页 |
| ·质粒与载体 | 第55页 |
| ·工具酶 | 第55页 |
| ·核酸分子量标准 | 第55页 |
| ·蛋白质分子量标准 | 第55-56页 |
| ·试剂盒 | 第56页 |
| ·试剂 | 第56页 |
| ·蛋白印迹转移膜 | 第56页 |
| ·溶液 | 第56-58页 |
| ·主要仪器设备 | 第58页 |
| ·方法 | 第58-60页 |
| ·原核重组表达质粒的构建 | 第58-59页 |
| ·重组表达质粒的鉴定 | 第59页 |
| ·目的基因的诱导表达 | 第59-60页 |
| ·表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 | 第60页 |
| ·表达产物的Western blot分析 | 第60页 |
| ·表达蛋白的可溶性分析 | 第60页 |
| ·包涵体的制备 | 第60页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第60页 |
| ·蛋白质的纯度鉴定与含量测定 | 第60页 |
| 3 结果 | 第60-66页 |
| ·原核重组表达质粒的构建 | 第60页 |
| ·阳性重组表达质粒的鉴定 | 第60-62页 |
| ·SDS-PAGE分析 | 第62-64页 |
| ·Western blot分析 | 第64页 |
| ·蛋白质的可溶性分析 | 第64-66页 |
| ·包涵体的制备与目的蛋白的纯化 | 第66页 |
| ·纯化蛋白质的浓度 | 第66页 |
| 4 讨论 | 第66-69页 |
| ·表达体系的选择 | 第66-68页 |
| ·包涵体的制备 | 第68页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第68页 |
| ·目的蛋白的活性 | 第68-69页 |
| 5. 小结 | 第69-70页 |
| 第三部分 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因真核表达载体的构建及表达 | 第70-80页 |
| 1 引言 | 第70页 |
| 2 材料与方法 | 第70-74页 |
| ·材料 | 第70-73页 |
| ·菌株 | 第70页 |
| ·细胞株 | 第70页 |
| ·质粒与表达载体 | 第70页 |
| ·工具酶 | 第70-71页 |
| ·核酸分子量标准 | 第71页 |
| ·试剂盒 | 第71页 |
| ·主要试剂 | 第71页 |
| ·溶液 | 第71-72页 |
| ·主要仪器设备 | 第72-73页 |
| ·方法 | 第73-74页 |
| ·真核表达质粒的构建 | 第73页 |
| ·重组表达质粒的筛选 | 第73页 |
| ·重组表达质粒的大量提取 | 第73页 |
| ·质粒的定量与纯度鉴定 | 第73页 |
| ·重组质粒转染BHK-21 | 第73页 |
| ·目的基因在BHK-21中的表达鉴定 | 第73-74页 |
| 3 结果 | 第74-78页 |
| ·真核表达质粒的构建 | 第74页 |
| ·重组表达质粒的鉴定 | 第74页 |
| ·质粒的含量和纯度 | 第74-76页 |
| ·荧光抗体检测 | 第76-77页 |
| ·RT-PCR鉴定结果 | 第77-78页 |
| 4 讨论 | 第78-79页 |
| ·表达质粒的选择 | 第78-79页 |
| ·脂质体介导法转染 | 第79页 |
| ·目的蛋白表达的检测 | 第79页 |
| 5 小结 | 第79-80页 |
| 第四部分 牛分枝杆菌主要保护性抗原基因对实验动物的免疫研究 | 第80-93页 |
| 1 引言 | 第80页 |
| 2 材料与方法 | 第80-84页 |
| ·材料 | 第80-82页 |
| ·真核表达质粒 | 第80页 |
| ·实验动物 | 第80页 |
| ·主要试剂 | 第80-81页 |
| ·溶液 | 第81-82页 |
| ·主要仪器设备 | 第82页 |
| ·方法 | 第82-84页 |
| ·重组表达质粒的大量制备与纯化 | 第82页 |
| ·重组表达质粒的定量与纯度鉴定 | 第82页 |
| ·实验动物免疫 | 第82-83页 |
| ·免疫小鼠血清中特异性抗体的检测 | 第83页 |
| ·免疫豚鼠变态反应检测 | 第83-84页 |
| ·细胞免疫检测 | 第84页 |
| 3 结果 | 第84-89页 |
| ·重组表达质粒的纯度 | 第84页 |
| ·免疫小鼠血清中特异性抗体的水平 | 第84-86页 |
| ·免疫小鼠淋巴细胞转化试验 | 第86页 |
| ·免疫小鼠CD4~+ T、CD8~+ T细胞数量 | 第86-87页 |
| ·豚鼠变态反应检测 | 第87-89页 |
| 4 讨论 | 第89-92页 |
| ·重组表达质粒的纯度 | 第89页 |
| ·免疫接种途径、方法及剂量 | 第89页 |
| ·免疫小鼠血清中特异性抗体的水平 | 第89-90页 |
| ·免疫小鼠的细胞免疫应答 | 第90-91页 |
| ·免疫豚鼠的变态反应 | 第91-92页 |
| 5 小结 | 第92-93页 |
| 结论 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-111页 |
| 缩略语表 | 第111-113页 |
| 致谢 | 第113-114页 |
| 作者简介 | 第114页 |
