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克雷伯氏菌甘油脱水酶和1,3-丙二醇氧化还原酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

第一章 前言第1-11页
   ·克雷伯氏菌第8-9页
   ·大肠杆菌表达系统第9-10页
   ·技术路线第10-11页
第二章 材料与方法第11-24页
   ·实验材料第11-16页
     ·菌株与质粒第11页
     ·酶与试剂第11页
     ·主要仪器设备第11-12页
     ·常用缓冲液配方第12-16页
   ·方法与步骤第16-24页
     ·Klebsiella pneumoniae的复苏培养第16页
     ·菌种的保存第16页
     ·Klebsiella pneumoniae基因组总DNA的制备第16页
     ·甘油脱水酶基因(dhaB)和1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)的引物设计和PCR扩增第16-18页
     ·大肠杆菌感受态的制备第18-19页
     ·质粒DNA的大量制备第19页
     ·少量提取质粒第19-20页
     ·DNA的酶切与连接第20页
     ·连接产物对大肠杆菌感受态细胞的转化第20页
     ·阳性克隆的筛选和酶切验证第20页
     ·重组子的质粒PCR验证第20-21页
     ·含RBS序列的dhaT基因扩增第21-22页
     ·菌液PCR第22页
     ·重组菌株的诱导表达第22页
     ·大肠杆菌细胞的破碎第22页
     ·甘油脱水酶活力的测定第22-23页
     ·外源基因在大肠杆菌中的表达检测第23页
     ·蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳第23页
     ·重组大肠杆菌利用甘油的摇瓶发酵实验第23-24页
第三章 结果和分析第24-46页
   ·甘油脱水酶基因(DHAB基因)表达质粒的构建第24-32页
     ·dhaB基因的克隆第25页
     ·pGEM-3zf+重组克隆质粒的验证第25-27页
     ·甘油脱水酶基因(dhaB)基因的序列分析第27-28页
     ·甘油脱水酶基因(dhaB)与pSE380载体的连接第28-30页
     ·甘油脱水酶活性的测定及SDS-PAGE检测第30-32页
   ·1,3-丙二醇氧化还原酶基因(DHAT)表达质粒的构建第32-38页
     ·dhaT基因的克隆第33-34页
     ·pGEM-13zf+重组克隆质粒的验证第34-35页
     ·dhaT基因的序列分析第35-36页
     ·1,3-丙二醇氧化还原酶基因(dhaT)与pSE380载体的连接第36-37页
     ·表达产物的SDS-PAGE分析第37-38页
   ·多顺反子表达质粒的构建第38-43页
     ·多顺反子表达质粒的构建第38-40页
     ·含RBS序列的dhaT基因扩增第40页
     ·多顺反子表达质粒的构建第40-41页
     ·PCR确定目的片段的插入方向第41-42页
     ·表达产物的SDS-PAGE分析第42-43页
   ·重组菌株甘油发酵实验第43-46页
第四章 讨论第46-50页
   ·甘油脱水酶基因的扩增第46页
   ·SD序列与ATG之间的距离第46页
   ·DNA的体外重组第46-47页
   ·外源基因在大肠杆菌中的表达第47-48页
   ·问题与展望第48-50页
第五章 结论第50-51页
参考文献第51-54页
致谢第54页

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