| 摘要 | 第1-13页 |
| Abstract | 第13-17页 |
| 第一章 文献综述 | 第17-37页 |
| 1 高等植物G 蛋白介导的信号传导研究进展 | 第18-25页 |
| ·G 蛋白概述 | 第18页 |
| ·植物体异三聚体G 蛋白信号组分 | 第18-21页 |
| ·异三聚体G 蛋白 | 第18-19页 |
| ·G 蛋白偶联受体（GPCR） | 第19页 |
| ·G 蛋白信号调节蛋白（RGS） | 第19-21页 |
| ·G 蛋白下游效应器 | 第21页 |
| ·异三聚体G 蛋白偶联信号途径 | 第21-25页 |
| ·G 蛋白与激素信号转导 | 第22-24页 |
| ·G 蛋白介导的生长素信号转导 | 第23页 |
| ·G 蛋白参与的ABA 介导的信号转导 | 第23-24页 |
| ·G 蛋白参与 GA 介导的信号转导 | 第24页 |
| ·G 蛋白与病原信号转导 | 第24-25页 |
| 2 高等植物RACK1 及其可能的生理生化功能 | 第25-29页 |
| ·RACK1 蛋白概述 | 第25-26页 |
| ·植物中的RACK1 蛋白 | 第26-28页 |
| ·植物中RACK1 的生理功能 | 第28-29页 |
| 3 蛋白质相互作用研究技术 | 第29-36页 |
| ·GST 融合蛋白pull-down 实验概述 | 第29-31页 |
| ·酵母双杂交系统简介 | 第31-36页 |
| ·酵母双杂交系统的基本原理 | 第31-32页 |
| ·酵母双杂交系统的组成 | 第32页 |
| ·酵母双杂交系统的缺陷 | 第32-33页 |
| ·酵母双杂交系统的改进与发展 | 第33-36页 |
| ·单杂交系统 | 第34页 |
| ·三杂交系统 | 第34页 |
| ·逆向双杂交系统 | 第34-35页 |
| ·核外双杂交系统 | 第35页 |
| ·哺乳动物双杂交系统 | 第35-36页 |
| 4 本研究的目的和研究内容 | 第36-37页 |
| 第二章 拟南芥RACK1 和AG81 蛋白的纯化 | 第37-61页 |
| 1 引言 | 第37-38页 |
| 2 材料与方法 | 第38-47页 |
| ·菌株与质粒 | 第38页 |
| ·酶与试剂 | 第38页 |
| ·培养基 | 第38页 |
| ·相关溶液的配制 | 第38-39页 |
| ·SDS-PAGE 电泳所需试剂配制 | 第38-39页 |
| ·目的蛋白表达纯化和相互作用所需母液配制 | 第39页 |
| ·主要实验仪器 | 第39页 |
| ·实验方法 | 第39-47页 |
| ·目的基因AtRACK1 和AGB1 的克隆 | 第39-40页 |
| ·凝胶回收PCR 产物 | 第40页 |
| ·目的基因连接到pMD 18-T simple vector | 第40页 |
| ·大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞的制备 | 第40-41页 |
| ·大肠杆菌（E.coli）DH5α的转化 | 第41页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第41-42页 |
| ·DNA 序列分析 | 第42页 |
| ·重组质粒pGEX-6P-1/AtRACK1 和pET32a/AG81 的构建 | 第42页 |
| ·pMD 18-T simple-AtRACK1/AG81 和pGEX-6P-1/pET32a 双酶切及纯化回收 | 第42页 |
| ·表达载体pGEX-6P-1/AtRACK1 和pET32a/ AG81 的构建 | 第42页 |
| ·连接重组子转化大肠杆菌BL21 | 第42-43页 |
| ·大肠杆菌BL21 感受态的制备（方法见2.6.4） | 第42页 |
| ·连接重组子的转化 | 第42-43页 |
| ·大肠杆菌BL21 中重组子的PCR 鉴定 | 第43页 |
| ·目的蛋白的诱导表达 | 第43-45页 |
| ·目的蛋白的初步诱导表达 | 第43页 |
| ·最适表达条件优化 | 第43-44页 |
| ·最适诱导剂浓度分析 | 第43-44页 |
| ·最适诱导时间分析 | 第44页 |
| ·最佳诱导温度分析 | 第44页 |
| ·目的蛋白的大量表达 | 第44-45页 |
| ·目的蛋白的分离纯化 | 第45-47页 |
| ·AtRACK1 蛋白的分离纯化 | 第45页 |
| ·GST 琼脂糖亲和层析 | 第45页 |
| ·Sephadex G-100 凝胶过滤 | 第45页 |
| ·AGB1 蛋白的分离纯化 | 第45-47页 |
| ·包涵体蛋白的变复性 | 第45-46页 |
| ·镍琼脂糖树脂亲和层析 | 第46-47页 |
| ·切胶回收蛋白 | 第47页 |
| ·蛋白质浓度测定（Bradford 法） | 第47页 |
| 3 结果与分析 | 第47-57页 |
| ·PCR 扩增目的基因AtRACK1 和AGB1 | 第47-48页 |
| ·TA 克隆产物鉴定 | 第48页 |
| ·序列比对结果 | 第48页 |
| ·目的基因与表达载体连接产物鉴定 | 第48-50页 |
| ·大肠杆菌BL21 重组子的鉴定 | 第50-51页 |
| ·目的蛋白的检测 | 第51-56页 |
| ·目的蛋白的小量表达 | 第51-52页 |
| ·目的蛋白的表达条件的优化 | 第52-54页 |
| ·IPTG 浓度的优化 | 第52页 |
| ·诱导时间的优化 | 第52-53页 |
| ·诱导温度的优化 | 第53-54页 |
| ·目的蛋白在宿主菌中的分布 | 第54页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第54-56页 |
| ·AtRACK1/GST 蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| ·AtRACK1/GST 蛋白过谷胱甘肽-琼脂糖树脂亲和柱 | 第54-55页 |
| ·AtRACK1/GST 融合蛋白过Sephadex G-100 | 第55页 |
| ·AGB1 蛋白的纯化 | 第55-56页 |
| ·AGB1 包涵体的获得 | 第55页 |
| ·AGB1 包涵体过镍琼脂糖树脂亲和层析柱 | 第55-56页 |
| ·胶回收蛋白 | 第56-57页 |
| ·蛋白收率计算 | 第57页 |
| 4 讨论 | 第57-61页 |
| 第三章 拟南芥RACK1 和AGB1 蛋白相互作用研究 | 第61-76页 |
| 1 前言 | 第61-62页 |
| 2 材料与方法 | 第62-67页 |
| ·实验材料 | 第62页 |
| ·酶与试剂 | 第62页 |
| ·培养基 | 第62页 |
| ·相关溶液的配制 | 第62-63页 |
| ·主要使用仪器 | 第63页 |
| ·试验方法 | 第63-67页 |
| ·GST pull down 实验方法 | 第63-64页 |
| ·酵母双杂交实验方法 | 第64-67页 |
| ·目的基因AtRACK1 和AGB1 的克隆 | 第64-65页 |
| ·凝胶回收PCR 产物（方法见第二章2.6.2） | 第65页 |
| ·目的基因连接到pMD 18-T simple vector | 第65页 |
| ·大肠杆菌（E.coli）DH5α感受态细胞的制备(方法见第二章2.6.4) | 第65页 |
| ·大肠杆菌（E.coli）DH5α的转化(方法见第二章2.6.5) | 第65页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第65页 |
| ·DNA 序列分析 | 第65页 |
| ·表达载体pGBKT7/AtRACK1 和pGADT7/AGB1 的构建 | 第65-66页 |
| ·pMD 18-T simple-AtRACK1和 pGBKT7/ pGADT7 分别双酶切及纯化回收 | 第65-66页 |
| ·表达载体pGBKT7/ AtRACK1 和pGADT7/ AGB1 的构建 | 第66页 |
| ·重组子pGBKT7/ AtRACK1 和pGADT7/ AGB1 的鉴定 | 第66页 |
| ·质粒的小量制备（方法见第二章2.6.6） | 第66页 |
| ·重组质粒的双酶切鉴定 | 第66页 |
| ·酵母宿主细胞AH109 的鉴定 | 第66页 |
| ·酵母感受态细胞的制备 | 第66页 |
| ·AtRACK1 和AGB1 蛋白的自身激活活性及毒性检测 | 第66-67页 |
| ·AtRACK1 和AGB1 蛋白相互作用的验证 | 第67页 |
| 3 结果与分析 | 第67-73页 |
| ·GST pull down 实验结果与分析 | 第67页 |
| ·酵母双杂交实验结果与分析 | 第67-73页 |
| ·PCR 扩增目的基因AtRACK1 和AGB1 | 第67-68页 |
| ·TA 克隆产物的鉴定 | 第68页 |
| ·序列比对结果 | 第68-69页 |
| ·目的基因与表达载体连接产物鉴定 | 第69-70页 |
| ·AH109 酵母表型验证 | 第70-71页 |
| ·AtRACK1 和AG81 蛋白自激活及毒性检测 | 第71-72页 |
| ·AtRACK1 蛋白和AG81 蛋白相互作用的验证 | 第72-73页 |
| 4 讨论 | 第73-76页 |
| 参考文献 | 第76-84页 |
| 附录 | 第84-92页 |
| 致谢 | 第92页 |
