| 中文摘要 | 第1-12页 |
| 英文摘要 | 第12-14页 |
| 1. 引言 | 第14-33页 |
| ·反向操作概况 | 第14-22页 |
| ·反向遗传技术原理 | 第14页 |
| ·反向遗传技术研究进展 | 第14-20页 |
| ·正链RNA 病毒研究进展 | 第14-15页 |
| ·负链RNA 病毒研究进展 | 第15-20页 |
| ·反向遗传常见表达系统 | 第20-22页 |
| ·RNA聚合酶II（RNA pol II)表达系统 | 第20-21页 |
| ·RNA 聚合酶I(RNA pol I)表达系统 | 第21页 |
| ·T7聚合酶系统 | 第21-22页 |
| ·新城疫概况 | 第22-30页 |
| ·新城疫病毒分子生物学 | 第22-24页 |
| ·基因组特点 | 第23页 |
| ·结构蛋白 | 第23-24页 |
| ·新城疫病毒复制过程 | 第24页 |
| ·新城疫反向遗传技术进展 | 第24-29页 |
| ·NDV感染性分子克隆的构建 | 第25-26页 |
| ·应用反遗传操作技术对NDV结构和功能研究的进展 | 第26-27页 |
| ·应用反遗传操作技术构建重组NDV疫苗载体 | 第27-29页 |
| ·新城疫V4 疫苗株概况 | 第29-30页 |
| ·传染性法氏囊病毒VP2 研究进展 | 第30-31页 |
| ·本课题拟解决的问题 | 第31-33页 |
| 2. 材料与方法 | 第33-49页 |
| ·病毒纯化 | 第33-35页 |
| ·病毒活化 | 第33页 |
| ·蚀斑纯化 | 第33-34页 |
| ·鸡胚成纤维细胞培养 | 第33页 |
| ·接种病毒 | 第33页 |
| ·覆盖琼脂 | 第33页 |
| ·蚀斑克隆化 | 第33-34页 |
| ·耐热实验及冻融实验 | 第34页 |
| ·PCR 测序 | 第34-35页 |
| ·引物设计 | 第34页 |
| ·RNA 的提取 | 第34页 |
| ·RT-PCR 反应 | 第34页 |
| ·PCR 产物纯化 | 第34-35页 |
| ·鸡胚半数感染量（EID_(50)）的测定及MDT 测定 | 第35页 |
| ·EID50的测定 | 第35页 |
| ·鸡胚平均致死时间(MDT)测定 | 第35页 |
| ·V4 株全长基因组测序及序列分析 | 第35-38页 |
| ·菌种与质粒 | 第35页 |
| ·主要工具酶及试剂 | 第35页 |
| ·主要仪器 | 第35页 |
| ·方法 | 第35-38页 |
| ·病毒的增殖 | 第35-36页 |
| ·病毒RNA 的提取 | 第36页 |
| ·反转录反应 | 第36页 |
| ·引物设计及PCR 反应 | 第36-38页 |
| ·全长基因组cDNA 克隆的构建 | 第38-40页 |
| ·全长cDNA克隆序列修改 | 第40-43页 |
| ·基因组6912nt 处缺失碱基的回复突变 | 第40-42页 |
| ·pF3T1 与pV4A 质粒的连接 | 第42页 |
| ·pF3T1+与原全长cDNA 质粒pBRT7－V4 的替换 | 第42页 |
| ·11764nt 处缺失碱基的回复突变 | 第42-43页 |
| ·合成序列与pBRT7－V4~Ф的替换连接 | 第43页 |
| ·II 型启动子全长cDNA 克隆的构建 | 第43页 |
| ·全长cDNA 中PmeI 酶切位点的引入及IBDV VP2 基因插入 | 第43-44页 |
| ·微型基因组的构建 | 第44-48页 |
| ·PCR 扩增及质粒构建 | 第44-46页 |
| ·Leader 区的扩增 | 第44页 |
| ·Trailer 区的扩增 | 第44-45页 |
| ·Leader 区和Trailer 区的连接 | 第45页 |
| ·融合PCR 产物与低拷贝载体pBR322 的连接 | 第45页 |
| ·EGFP 扩增及微型基因组构建 | 第45-46页 |
| ·微基因组表达验证实验及转染效率比较 | 第46页 |
| ·辅助病毒包装实验 | 第46页 |
| ·BSR 细胞功能鉴定 | 第46-48页 |
| ·病毒的拯救 | 第48-49页 |
| 3 结果 | 第49-91页 |
| ·病毒纯化 | 第49-53页 |
| ·蚀斑纯化实验 | 第49页 |
| ·耐热实验及抗冻融实验 | 第49-52页 |
| ·针对F 基因编码区47-435bp 的特异扩增 | 第52-53页 |
| ·鸡胚半数感染量（EID_(50)）及平均致死时间(MDT)的测定 | 第53页 |
| ·V4 株全长基因组序列测定及序列分析 | 第53-60页 |
| ·PCR 结果及重组质粒鉴定结果 | 第53-54页 |
| ·序列比较分析 | 第54-58页 |
| ·NP 基因序列分析 | 第55-56页 |
| ·P 基因序列分析 | 第56-57页 |
| ·M 基因序列分析 | 第57-58页 |
| ·F 基因序列分析 | 第58页 |
| ·HN 基因序列分析 | 第58页 |
| ·L 基因序列分析 | 第58页 |
| ·耐热性相关基因分析 | 第58-60页 |
| ·全长cDNA克隆的构建 | 第60-76页 |
| ·各片段cDNA 合成PCR 结果 | 第60-61页 |
| ·中间部分cDNA 片段的连接 | 第61-72页 |
| ·pF456 质粒的构建 | 第61-65页 |
| ·pF23 质粒的构建 | 第65-66页 |
| ·pF26 质粒的构建 | 第66-69页 |
| ·pF789 质粒的构建 | 第69-71页 |
| ·pF29 质粒的构建 | 第71-72页 |
| ·两末端cDNA 片段的连接 | 第72-74页 |
| ·pF1 质粒的构建 | 第72页 |
| ·pF10 质粒的构建 | 第72-73页 |
| ·pT7－F110 和pPolII－F110 | 第73-74页 |
| ·全长cDNA 质粒pBRT7－V4 和pBRPolII-V4 的构建 | 第74-76页 |
| ·全长cDNA 克隆序列修正 | 第76-81页 |
| ·基因组6912nt 处缺失碱基的回复突变 | 第76页 |
| ·pF3T1 与V4A 质粒的连接 | 第76-77页 |
| ·质粒pF3T1+与pBRT7－V4 的替换 | 第77页 |
| ·11764nt 处缺失碱基的回复突变 | 第77页 |
| ·合成序列与pBRT7－V4~Ф的替换连接 | 第77-81页 |
| ·II 型启动子全长cDNA 克隆的构建 | 第81页 |
| ·全长cDNA 中PmeI 酶切位点的引入及IBDV VP2 基因插入 | 第81-84页 |
| ·微型基因组的构建 | 第84-90页 |
| ·Leader、Trailer 区的扩增及连接 | 第84-85页 |
| ·EGFP 扩增及微型基因组构建 | 第85页 |
| ·融合PCR 产物与低拷贝载体pBR322 的连接 | 第85-87页 |
| ·微基因组表达验证实验及转染效率比较 | 第87-88页 |
| ·微基因组包装实验 | 第88-90页 |
| ·BSR 细胞功能鉴定 | 第90页 |
| ·病毒的拯救 | 第90-91页 |
| 4 讨论 | 第91-95页 |
| ·病毒的纯化 | 第91页 |
| ·全长cDNA 克隆的获得 | 第91-92页 |
| ·NDV 做为疫苗载体的可行性 | 第92-94页 |
| ·微基因组表达成功及病毒拯救失败带来的启示 | 第94页 |
| ·II 型启动子在NDV 拯救中的应用 | 第94-95页 |
| 5 结论 | 第95-96页 |
| 致谢 | 第96-97页 |
| 参考文献 | 第97-104页 |
| 附表 | 第104-112页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第112页 |
