| 摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-6页 |
| 目录 | 第6-9页 |
| 第一章 前言 | 第9-19页 |
| 1 引言 | 第9-11页 |
| 2 蓝藻抗病毒蛋白-N(Cyanovirin-N) | 第11-13页 |
| ·CVN的结构 | 第11页 |
| ·CVN的抗病毒机理 | 第11-12页 |
| ·CVN抗病毒活性的研究 | 第12-13页 |
| 3 Linker序列 | 第13页 |
| 4 重组蛋白的聚乙二醇(PEG)修饰 | 第13-17页 |
| ·蛋白质化学修饰研究进展 | 第13-14页 |
| ·蛋白质PEG修饰研究进展 | 第14-15页 |
| ·蛋白质PEG修饰的原理和方法 | 第15页 |
| ·蛋白质N-末端位点特异性的PEG修饰 | 第15-16页 |
| ·CVN蛋白PEG修饰研究进展 | 第16页 |
| ·蛋白质PEG修饰产物的分离纯化 | 第16-17页 |
| 5 研究目的和意义 | 第17页 |
| 6 技术路线 | 第17-19页 |
| 第二章 实验材料与设备 | 第19-25页 |
| 1 主要仪器设备 | 第19-20页 |
| 2 DNA及蛋白酶 | 第20页 |
| 3 菌株、细胞株及病毒 | 第20页 |
| 4 培养基和抗生素 | 第20页 |
| 5 实验试剂 | 第20-25页 |
| ·常用试剂 | 第20-21页 |
| ·工具酶 | 第21页 |
| ·分子量参照物 | 第21页 |
| ·试剂配制 | 第21-25页 |
| 第三章 实验方法与步骤 | 第25-40页 |
| 1 SUMO-LCVN基因的合成 | 第25-28页 |
| ·引物设计与合成 | 第25页 |
| ·PCR合成SUMO-LCVN全序列 | 第25-28页 |
| 2 表达质粒pET3c-SUMO-LCVN的构建及序列分析 | 第28-31页 |
| ·表达载体pET3c质粒的抽提 | 第28页 |
| ·SUMO-LCVN cDNA和表达载体pET3c的双酶切 | 第28-29页 |
| ·酶切产物的回收 | 第29页 |
| ·连接反应 | 第29页 |
| ·感受态大肠杆菌DH5a的制备 | 第29-30页 |
| ·连接产物的转化 | 第30页 |
| ·重组子的鉴定 | 第30-31页 |
| 3 SUMO-LCVN在大肠杆菌中的表达 | 第31-33页 |
| ·感受态大肠杆菌BL21(DE3)的制备 | 第31页 |
| ·重组质粒pET3c-SUMO-LCVN的转化 | 第31页 |
| ·SUMO-LCVN表达菌的筛选 | 第31页 |
| ·菌种的培养 | 第31页 |
| ·菌体裂解上清制备 | 第31-32页 |
| ·LCVN工程菌的中试发酵 | 第32页 |
| ·SDS-PAGE电泳检测 | 第32-33页 |
| 4 LCVN蛋白纯化与鉴定 | 第33-35页 |
| ·重组LCVN蛋白纯化的技术路线 | 第33页 |
| ·SUMO-LCVN融合蛋白的纯化 | 第33页 |
| ·SUMO-LCVN融合蛋白脱咪唑 | 第33-34页 |
| ·SUMO-LCVN融合蛋白的酶切 | 第34页 |
| ·酶切产物的Ni-NTA柱的再纯化 | 第34页 |
| ·Tricine-SDS-PAGE检测 | 第34-35页 |
| ·蛋白浓度测定(BCA法) | 第35页 |
| ·RP-HPLC分析LCVN蛋白纯度 | 第35页 |
| ·重组LCVN蛋白分子量的测定 | 第35页 |
| 5 重组LCVN蛋白多克隆抗体的制备 | 第35-36页 |
| ·制备流程 | 第35-36页 |
| ·western blotting鉴定多克隆抗体的特异性 | 第36页 |
| ·ELASA检测抗血清的效价 | 第36页 |
| 6 LCVN的PEG修饰 | 第36-37页 |
| ·PEG修饰反应pH和摩尔比的筛选 | 第36-37页 |
| ·反应时间对PEG修饰效率的影响 | 第37页 |
| ·PEG修饰产物的分离 | 第37页 |
| 7 LCVN及其PEG修饰产物与gpl20蛋白的结合率 | 第37页 |
| 8 LCVN及其单PEG修饰产物抗病毒活性测定 | 第37-40页 |
| ·抗HSV-1活性测定 | 第37-38页 |
| ·WST法测定LCVN及其PEG修饰产物对T细胞的毒性 | 第38页 |
| ·WST法测定LCVN及其PEG修饰产物抗HIV-1活性 | 第38页 |
| ·融合抑制法测定LCVN及其PEG修饰产物抗HIV-1活性 | 第38-40页 |
| 第四章 实验结果 | 第40-53页 |
| 1 重组LCVN蛋白的表达、纯化 | 第40-43页 |
| ·重组质粒pET3c-SUMO-LCVN的构建 | 第40页 |
| ·SUMO-LCVN蛋白的诱导表达 | 第40-41页 |
| ·重组LCVN蛋白的纯化 | 第41页 |
| ·SUMO-LCVN与SUMO-CVN蛋白对SUMO蛋白酶敏感性的比较 | 第41-42页 |
| ·重组LCVN蛋白纯度鉴定 | 第42页 |
| ·重组LCVN蛋白分子量测定 | 第42-43页 |
| 2 LCVN的PEG修饰 | 第43-46页 |
| ·PEG修饰反应pH、投料比的筛选 | 第43-44页 |
| ·反应时间对PEG修饰的影响 | 第44-45页 |
| ·LCVN PEG修饰产物的分离纯化 | 第45-46页 |
| 3 LCVN多抗的制备 | 第46-47页 |
| ·western boltting鉴定LCVN多抗的特异性 | 第46-47页 |
| ·ELISA法测定LCVN多抗的效价 | 第47页 |
| 4 LCVN及其PEG修饰产物与gpl20蛋白的结合率 | 第47-48页 |
| 5 LCVN及其PEG修饰产物抗病毒活性测定 | 第48-53页 |
| ·MTT法测定LCVN抗HSV-1活性 | 第48-49页 |
| ·WST法测定LCVN及其PEG修饰产物对T细胞的毒性 | 第49-50页 |
| ·WST法测定LCVN及其PEG修饰产物抗HIV-1活性 | 第50-51页 |
| ·融合抑制法测定LCVN及其PEG修饰产物抗HIV-1活性 | 第51-53页 |
| 第五章 讨论 | 第53-60页 |
| 1 杀微生物剂 | 第53-54页 |
| 2 连接肽(Linker)序列 | 第54-56页 |
| ·Linker序列的研究进展 | 第54页 |
| ·重组LCVN蛋白的优势 | 第54-56页 |
| 3 LCVN的PEG修饰 | 第56-58页 |
| ·PEG修饰反应类型 | 第56-57页 |
| ·CVN的PEG修饰位点的选择 | 第57页 |
| ·PEG修饰条件的筛选 | 第57-58页 |
| 4 LCVN单PEG修饰产物的抗病毒活性 | 第58-60页 |
| 结论及展望 | 第60-61页 |
| 1 结论 | 第60页 |
| 2 展望 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-66页 |
| 基金资助 | 第66-67页 |
| 发表论文及专利 | 第67-68页 |
| 缩写词 中英文对照表 | 第68-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
