| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-11页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-20页 |
| 1.1 泛素化途径 | 第12-13页 |
| 1.2 类泛素化修饰 | 第13-14页 |
| 1.2.1 SUMO修饰(Sumoylation) | 第13页 |
| 1.2.2 Nedd8修饰(Neddylation) | 第13-14页 |
| 1.2.3 ISG15修饰(ISGylation) | 第14页 |
| 1.3 泛素激活酶UBE1 | 第14-15页 |
| 1.4 Uba6 | 第15-16页 |
| 1.5 Uba7 | 第16-17页 |
| 1.6 模式生物斑马鱼 | 第17页 |
| 1.7 本项目的立项依据、目的和意义 | 第17-20页 |
| 第二部分 材料和方法 | 第20-42页 |
| 2.1 实验动物 | 第20页 |
| 2.2 仪器、试剂和耗材 | 第20-21页 |
| 2.2.1 主要仪器 | 第20-21页 |
| 2.2.2 试剂和耗材 | 第21页 |
| 2.3 试剂配方 | 第21-24页 |
| 2.3.1 LB培养基 | 第21-22页 |
| 2.3.2 原位杂交相关试剂 | 第22-24页 |
| 2.4 大肠杆菌(E.coli)化学感受态细胞的制备 | 第24-25页 |
| 2.5 Taq DNA polymerase的制备与提纯 | 第25页 |
| 2.6 斑马鱼total RNA提取及cDNA合成 | 第25-27页 |
| 2.6.1 斑马鱼total RNA提取 | 第25-26页 |
| 2.6.2 斑马鱼cDNA合成 | 第26-27页 |
| 2.7 目的基因扩增、重组和转化 | 第27-29页 |
| 2.7.1 目的基因的扩增—聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction) | 第27页 |
| 2.7.2 PCR产物的纯化 | 第27-28页 |
| 2.7.3 目的基因的重组 | 第28-29页 |
| 2.7.4 重组质粒的转化—化学转化法 | 第29页 |
| 2.8 重组质粒的筛选、纯化与鉴定 | 第29-31页 |
| 2.8.1 重组质粒的筛选 | 第29-30页 |
| 2.8.2 重组质粒的纯化 | 第30-31页 |
| 2.8.3 重组质粒的鉴定 | 第31页 |
| 2.9 反义RNA探针的制备 | 第31-33页 |
| 2.9.1 线性化模板 | 第31-32页 |
| 2.9.2 反义RNA探针的合成和纯化 | 第32-33页 |
| 2.10 mRNA的合成 | 第33-34页 |
| 2.10.1 mRNA合成质粒模板线性化 | 第33-34页 |
| 2.11 全胚RNA原位杂交(Whole Mount RNA in situ hybridization) | 第34-36页 |
| 2.11.1 胚胎的收集和固定 | 第34-35页 |
| 2.11.2 原位杂交 | 第35-36页 |
| 2.12 显微注射 | 第36-37页 |
| 2.12.1 准备工作 | 第36页 |
| 2.12.2 注射 | 第36-37页 |
| 2.13 ISG15蛋白纯化 | 第37-38页 |
| 2.13.1 目的基因的原核表达 | 第37页 |
| 2.13.2 目的蛋白的大量表达 | 第37页 |
| 2.13.3 菌体破碎和蛋白纯化 | 第37-38页 |
| 2.14 多克隆抗体制备 | 第38-39页 |
| 2.14.1 抗原的准备 | 第38页 |
| 2.14.2 注射抗原 | 第38-39页 |
| 2.15 蛋白western blot检测 | 第39-42页 |
| 2.15.1 斑马鱼胚胎蛋白的抽提 | 第39页 |
| 2.15.2 SDS-PAGE | 第39-41页 |
| 2.15.3 strpping | 第41-42页 |
| 第三部分 结果分析与讨论 | 第42-60页 |
| 3.1 uba6和uba7基因表达图谱 | 第42-43页 |
| 3.2 斑马鱼中uba6和uba7基因敲除 | 第43-45页 |
| 3.3 uba6和uba7突变体表型分析 | 第45-47页 |
| 3.3.1 uba6突变体表型 | 第45-46页 |
| 3.3.2 uba7突变体表型 | 第46-47页 |
| 3.3.3 uba6和uba7突变体real-time PCR检测 | 第47页 |
| 3.4 Uba7-ISG15途径在先天免疫中的作用 | 第47-50页 |
| 3.5 uba7对ube1突变体挽救 | 第50-56页 |
| 3.5.1 ube1突变体表型 | 第50页 |
| 3.5.2 ube1突变体胰腺缺陷及挽救 | 第50-53页 |
| 3.5.3 ube1突变体肝脏缺陷及挽救 | 第53-56页 |
| 3.6 ube1和uba6双突变体表型分析 | 第56-57页 |
| 3.7 讨论与分析 | 第57-60页 |
| 3.7.1 uba6和uba7突变体表型分析 | 第58页 |
| 3.7.2 uba6和uba7突变体real-time PCR检测结果分析 | 第58-59页 |
| 3.7.3 ube1突变体表型挽救结果分析 | 第59页 |
| 3.7.4 ube1和uba6双突变体表型分析 | 第59-60页 |
| 第四部分 结论与展望 | 第60-62页 |
| 4.1 斑马鱼早期胚胎发育中uba6和uba7的基因功能 | 第60页 |
| 4.2 外源性uba7 mRNA对ube1突变体的挽救 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-68页 |
| 致谢 | 第68页 |
