| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7页 |
| 前言 | 第8-17页 |
| 实验材料和方法 | 第17-34页 |
| 一、实验材料 | 第17-19页 |
| 1. 主要仪器 | 第17-18页 |
| 2. 主要试剂 | 第18页 |
| 3. 菌毒株,载体质粒和实验动物 | 第18-19页 |
| 二、实验方法 | 第19-34页 |
| 1. 构建pETP6重组质粒并鉴定 | 第19-24页 |
| 1.1合成引物 | 第19页 |
| 1.2 TB-Chen株RV VP6全编码基因组的PCR扩增 | 第19-20页 |
| 1.3 回收PCR扩增产物 | 第20页 |
| 1.4 制备连接片段并进行连接和转化 | 第20-22页 |
| 1.4.1 连接片段的制备 | 第20-21页 |
| 1.4.2 VP6基因与pETL载体酶切片段连接 | 第21页 |
| 1.4.3 连接反应产物转化DH5 α感受态细胞 | 第21-22页 |
| 1.5 重组表达质粒pETP6的制备及鉴定 | 第22-24页 |
| 1.5.1 碱裂解法小量制备质粒DNA | 第22页 |
| 1.5.2 Nde Ⅰ/BamH Ⅰ酶切鉴定重组表达质粒 | 第22-23页 |
| 1.5.3 大量制备质粒DNA | 第23页 |
| 1.5.4 核苷酸序列测定 | 第23-24页 |
| 2. pETP6v载体质粒的构建及鉴定 | 第24-28页 |
| 2.1 酶切位点的的确定及引物设计 | 第24页 |
| 2.2 携带单一个外源抗原表位插入酶切位点的载体质粒的构建 | 第24-28页 |
| 2.2.1 携带Sac Ⅰ酶切位点的插入片段的制备 | 第24-25页 |
| 2.2.2 载体片段制备 | 第25-26页 |
| 2.2.3 插入片段与载体质粒酶切片段的连接 | 第26页 |
| 2.2.4 连接反应产物转化DH5α大肠杆菌细胞 | 第26页 |
| 2.2.5 碱裂解法小量制备质粒DNA | 第26-27页 |
| 2.2.6 酶切鉴定重组表达质粒pETP6v(Sac Ⅰ) | 第27页 |
| 2.2.7 大量制备质粒DNA | 第27页 |
| 2.2.8 核苷酸序列测定 | 第27-28页 |
| 3. 携带6个外源抗原表位插入酶切位点的pETP6v载体质粒的构建 | 第28-29页 |
| 4. 携带PV3抗原表位重组表达质粒pEPT6F308X/PV_3N_1 | 第29-31页 |
| 4.1 外源抗原表位(PV3N1)的设计 | 第29页 |
| 4.2 引物互补片段的制备 | 第29页 |
| 4.3 载体质粒pETP6F酶切片段的制备 | 第29-30页 |
| 4.4 插入片段和载体质粒pETP6v酶切片段的连接及转化 | 第30页 |
| 4.5 连接反应产物转化DH5α大肠杆菌细胞 | 第30页 |
| 4.6 碱裂解法小量制备质粒DNA | 第30页 |
| 4.7 酶切鉴定重组表达质粒 | 第30页 |
| 4.8 大量制备质粒DNA | 第30-31页 |
| 4.9 核苷酸序列测定 | 第31页 |
| 5. 重组VP6F载体蛋白和重组嵌合蛋白6F/PV_3N_1在大肠杆菌中的表达 | 第31-32页 |
| 6. 重组载体蛋白和重组嵌合蛋白的纯化 | 第32页 |
| 7. 动物免疫及血清抗体的制备 | 第32页 |
| 7.1 实验动物分组 | 第32页 |
| 7.2 免疫方案 | 第32页 |
| 8. Western blot检测纯化的重组嵌合蛋白的免疫原性 | 第32-34页 |
| 结果与分析 | 第34-38页 |
| 1. 质粒的构建 | 第34-35页 |
| 1.1 VP6基因的扩增 | 第34页 |
| 1.2 携带RV VP6基因的重组表达质粒pETP6的构建及鉴定 | 第34-35页 |
| 1.3 携带外源抗原表位的重组表达质粒pETP6F308X/PV_3N_1 | 第35页 |
| 2. 重组嵌合蛋白在BL21(DE3)中的表达 | 第35-36页 |
| 3. Western blot分析 | 第36-38页 |
| 讨论 | 第38-41页 |
| 小结 | 第41-42页 |
| 参考文献 | 第42-47页 |
| 附录 | 第47-68页 |
| (一) 缩略词 | 第47-49页 |
| (二) 主要溶液配方 | 第49-58页 |
| (三) 主要实验步骤 | 第58-66页 |
| (四) RV TB-Chen株VP6编码基因核苷酸序列及氨基酸序列 | 第66-68页 |
| 致谢 | 第68-69页 |
| 研究生简历 | 第69-70页 |
