| 摘要 | 第2-4页 |
| Abstract | 第4-5页 |
| 中文文摘 | 第6-13页 |
| 符号说明 | 第13-15页 |
| 绪论 | 第15-27页 |
| 1 阿维菌素及其重要衍生物 | 第15-18页 |
| 2 阿维菌素的生物合成 | 第18-23页 |
| 2.1 阿维菌素生物合成途径 | 第18-21页 |
| 2.2 阿维菌素生物合成中相关基因的功能分析 | 第21-23页 |
| 3 阿维菌素B1a高产的育种策略 | 第23-25页 |
| 3.1 诱变育种 | 第23页 |
| 3.2 代谢工程育种 | 第23-24页 |
| 3.3 基因组改组 | 第24页 |
| 3.4 基因敲除育种 | 第24-25页 |
| 4 阿维菌素B1a高产的发酵策略 | 第25页 |
| 5 国内外阿维菌素B1a育种及研究现状 | 第25-26页 |
| 6 本课题的研究的目的意义及主要研究内容 | 第26-27页 |
| 6.1 研究的目的意义 | 第26页 |
| 6.2 主要研究内容 | 第26-27页 |
| 第一章 阿维菌素B1a组分高产菌株的选育 | 第27-49页 |
| 第一节 材料与方法 | 第28-34页 |
| 1 材料 | 第28-30页 |
| 1.1 菌种 | 第28页 |
| 1.2 培养基与溶液 | 第28页 |
| 1.3 主要药品和试剂 | 第28-29页 |
| 1.4 仪器设备 | 第29-30页 |
| 2 实验方法 | 第30-34页 |
| 2.1 阿维链霉菌高产菌株选育简明技术路线图 | 第30页 |
| 2.2 孢子诱变 | 第30-32页 |
| 2.2.1 出发菌株A的复壮 | 第30-31页 |
| 2.2.2 阿维菌素B1a筛选方法的建立 | 第31页 |
| 2.2.3 阿维链霉菌的孢子萌发 | 第31页 |
| 2.2.4 二乙烯亚胺对孢子的致死曲线 | 第31页 |
| 2.2.5 阿维链霉菌对链霉素的耐受度 | 第31-32页 |
| 2.3 原生质体诱变和再生 | 第32-33页 |
| 2.3.1 菌株生长曲线的绘制 | 第32页 |
| 2.3.2 酶解破壁制备原生质体 | 第32页 |
| 2.3.3 原生质体的再生 | 第32页 |
| 2.3.4 原生质体计数 | 第32-33页 |
| 2.3.5 紫外诱变原生质体 | 第33页 |
| 2.4 基因组改组 | 第33-34页 |
| 第二节 结果与分析 | 第34-48页 |
| 1 孢子诱变 | 第34-40页 |
| 1.1 原始菌株A的复壮 | 第34页 |
| 1.2 分光光度计及HPLC法测定阿维菌素B1a含量相关性 | 第34-36页 |
| 1.3 孢子悬液中菌丝的显微生长图 | 第36-37页 |
| 1.4 二乙烯亚胺对阿维链霉菌的致死曲线 | 第37页 |
| 1.5 阿维菌素对链霉菌的耐受度 | 第37-38页 |
| 1.6 二乙烯亚胺诱变结合链霉素抗性筛选高产阿维链霉菌的结果 | 第38-40页 |
| 2 原生质体制备和再生 | 第40-45页 |
| 2.1 阿维链霉菌的生长曲线的绘制 | 第40-41页 |
| 2.2 不同浓度的甘氨酸对菌体生长的影响 | 第41页 |
| 2.3 不同酶浓度对原生质体的形成及再生的影响 | 第41-42页 |
| 2.4 不同酶解时间对原生质体形成的影响 | 第42页 |
| 2.5 紫外照射时间对原生质体的影响 | 第42-43页 |
| 2.6 原生质体诱变与再生结果 | 第43-45页 |
| 3 基因组改组 | 第45-48页 |
| 3.1 亲本原生质体灭活 | 第45-46页 |
| 3.2 基因组改组结果 | 第46-48页 |
| 第三节 小结与讨论 | 第48-49页 |
| 第二章 O-甲基转移酶基因aveD基因的敲除 | 第49-73页 |
| 第一节 材料与方法 | 第49-61页 |
| 1 实验材料 | 第49-52页 |
| 1.1 菌株,载体和质粒 | 第49-50页 |
| 1.2 主要试剂 | 第50页 |
| 1.3 主要仪器 | 第50-51页 |
| 1.4 主要培养基 | 第51页 |
| 1.5 主要溶液 | 第51-52页 |
| 1.6 本实验所用PCR引物 | 第52页 |
| 2 实验方法 | 第52-61页 |
| 2.1 确认是否存在O-甲基转移酶基因aveD基因 | 第52-55页 |
| 2.1.1 菌体培养 | 第52页 |
| 2.1.2 链霉菌总DNA的少量快速提取 | 第52-53页 |
| 2.1.3 aveD基因扩增 | 第53页 |
| 2.1.4 aveD基因片段回收 | 第53页 |
| 2.1.5 构建含aveD片段的pMDaveD质粒 | 第53-55页 |
| 2.2 aveD基因敲除质粒的构建 | 第55-60页 |
| 2.2.1 扩增aveD基因的上下游片段 | 第56-57页 |
| 2.2.2 扩增上下游片段的PCR验证 | 第57-58页 |
| 2.2.3 PSK1、PSK3和PSK5质粒的构建 | 第58-59页 |
| 2.2.4 PSK8质粒的构建 | 第59页 |
| 2.2.5 P0J10质粒的构建 | 第59-60页 |
| 2.2.6 PSK10质粒的构建 | 第60页 |
| 2.3 敲除质粒导入阿维链霉菌 | 第60-61页 |
| 2.4 敲除菌株的验证 | 第61页 |
| 第二节 结果与分析 | 第61-70页 |
| 1 验证阿维链霉菌中是否存在O-甲基转移酶基因aveD基因 | 第61-62页 |
| 2 敲除质粒的构建 | 第62-70页 |
| 2.1 arveD基因上下游片段的扩增 | 第62-63页 |
| 2.2 PSK1、PSK3和PSK5质粒的构建 | 第63-64页 |
| 2.3 PSK8质粒的构建和筛选 | 第64-65页 |
| 2.4 POJ10质粒的构建和筛选 | 第65-66页 |
| 2.5 PSK10质粒的构建和筛选 | 第66页 |
| 2.6 验证菌株是否具有Thio、Apra和Apc抗性 | 第66页 |
| 2.7 敲除菌株的筛选 | 第66-70页 |
| 2.7.1 敲除菌株的PCR验证 | 第66-67页 |
| 2.7.2 敲除菌株发酵液组分的分析 | 第67-70页 |
| 第三节 小结与讨论 | 第70-73页 |
| 第三章 聚酮合成酶aveA1的脱水酶基因替换 | 第73-89页 |
| 第一节 材料与方法 | 第74-79页 |
| 1 实验材料 | 第74-75页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第74-75页 |
| 1.2 主要试剂 | 第75页 |
| 1.3 主要仪器 | 第75页 |
| 1.4 培养基 | 第75页 |
| 1.5 主要溶液 | 第75页 |
| 1.6 本实验所用PCR引物 | 第75页 |
| 2 实验方法 | 第75-79页 |
| 2.1 聚酮合成酶aveA1的脱水酶基因的敲除质粒的构建 | 第75-77页 |
| 2.1.1 脱水酶基团上下游目的条带的扩增 | 第76页 |
| 2.1.2 上下游片段的目的条带回收 | 第76页 |
| 2.1.3 脱水基团敲除质粒GSKA1的构建 | 第76-77页 |
| 2.1.4 脱水基团敲除质粒GSKA2的构建 | 第77页 |
| 2.2 含红霉素eryAⅡ module 4脱水酶基因替换质粒的构建 | 第77-79页 |
| 2.2.1 GSKA3的构建 | 第77-78页 |
| 2.2.2 GSKA4的构建 | 第78-79页 |
| 2.3 敲除质粒和替换质粒的效果验证 | 第79页 |
| 第二节 结果与分析 | 第79-87页 |
| 2.1 聚酮合成酶aveA1的脱水酶基因的敲除质粒的构建 | 第79-83页 |
| 2.1.1 阿维链霉菌脱水基因的扩增 | 第79-80页 |
| 2.1.2 GSKA1质粒的筛选 | 第80-81页 |
| 2.1.3 GSKA2质粒的筛选 | 第81-83页 |
| 2.2 含红霉素eryAⅡ module 4脱水酶基因替换质粒的构建 | 第83-86页 |
| 2.2.1 GSKA3质粒的筛选 | 第83-84页 |
| 2.2.2 GSKA4质粒的筛选 | 第84-86页 |
| 2.3 敲除质粒和替换质粒的效果验证 | 第86-87页 |
| 第三节 小结与讨论 | 第87-89页 |
| 第四章 总结与展望 | 第89-91页 |
| 1 总结 | 第89页 |
| 2 展望 | 第89-91页 |
| 2.1 脱水酶替换菌株的筛选 | 第89页 |
| 2.2 阿维菌素“b”组分的敲除 | 第89-90页 |
| 2.3 对比高产菌株与低产菌株基因及蛋白的差异 | 第90页 |
| 2.4 发酵工艺优化 | 第90-91页 |
| 附录 | 第91-95页 |
| 参考文献 | 第95-101页 |
| 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果 | 第101-103页 |
| 致谢 | 第103-105页 |
| 个人简历 | 第105-109页 |
