| 摘要 | 第8-10页 |
| Abstract | 第10-11页 |
| 第一章 前言 | 第12-23页 |
| 1 水稻草状矮化病毒研究概况 | 第12-16页 |
| 1.1 病毒的发现、分布与危害 | 第12页 |
| 1.2 RGSV的症状 | 第12-13页 |
| 1.3 RGSV与寄主和介体的关系及其传播特性 | 第13页 |
| 1.4 RGSV的形态及结构及蛋白功能 | 第13-15页 |
| 1.5 RGSV的鉴定与防治 | 第15-16页 |
| 2 植物DNA甲基化的概况 | 第16-22页 |
| 2.1 DNA甲基化的概述与研究进展 | 第16-17页 |
| 2.2 植物DNA甲基化的特点 | 第17-19页 |
| 2.3 植物DNA甲基化与表型的关系 | 第19-20页 |
| 2.4 植物DNA甲基化的检测方法 | 第20-21页 |
| 2.5 植物DNA甲基化与植物病毒病 | 第21-22页 |
| 3 本研究的目的及意义 | 第22-23页 |
| 第二章 水稻草状矮化病毒病株甲基化相关基因的表达量检测 | 第23-31页 |
| 1 材料及仪器 | 第23-24页 |
| 1.1 材料 | 第23页 |
| 1.2 主要试剂 | 第23-24页 |
| 1.3 实验仪器 | 第24页 |
| 2 方法 | 第24-28页 |
| 2.1 RGSV毒株的鉴定 | 第24-26页 |
| 2.1.1 水稻叶片总RNA的提取及基因组DNA的消化 | 第24页 |
| 2.1.2 RGSV的检测 | 第24-25页 |
| 2.1.3 病毒基因的反转录 | 第25页 |
| 2.1.4 多重PCR同时检测RGSV与RRSV,获得RGSV单毒阳性植株 | 第25-26页 |
| 2.2 目的基因表达量的检测 | 第26-28页 |
| 2.2.1 目的基因荧光定量PCR实验的反转录 | 第26页 |
| 2.2.2 荧光定量PCR引物的设计 | 第26-27页 |
| 2.2.3 目的基因的荧光定量PCR检测 | 第27-28页 |
| 2.2.4 RGSV侵染的水稻中相关基因的表达量 | 第28页 |
| 3 结果分析 | 第28-30页 |
| 3.1 RGSV的检测结果 | 第28-29页 |
| 3.2 目的基因及其内参基因的溶解曲线 | 第29页 |
| 3.3 RGSV侵染的水稻中相关基因的表达量 | 第29-30页 |
| 4 小结与讨论 | 第30-31页 |
| 第三章 目的基因过表达和RNA干扰载体构建及遗传转化 | 第31-52页 |
| 1 材料 | 第31-32页 |
| 1.1 实验材料 | 第31页 |
| 1.2 供试材料 | 第31页 |
| 1.3 主要仪器 | 第31-32页 |
| 2 实验方法 | 第32-43页 |
| 2.1 植物过表达载体的构建 | 第32-36页 |
| 2.1.1 引物设计 | 第32页 |
| 2.1.2 水稻叶片RNA提取 | 第32页 |
| 2.1.3 反转录 | 第32-33页 |
| 2.1.4 目的基因的PCR扩增 | 第33页 |
| 2.1.5 DNA片段的电泳检测及回收纯化 | 第33-34页 |
| 2.1.6 克隆载体的连接 | 第34页 |
| 2.1.7 连接产物转化大肠杆菌T1感受态细胞 | 第34页 |
| 2.1.8 阳性克隆PCR筛选及测序鉴定 | 第34页 |
| 2.1.9 质粒提取 | 第34-35页 |
| 2.1.10 质粒的酶切 | 第35页 |
| 2.1.11 酶切产物回收及植物表达载体pXQ的连接 | 第35-36页 |
| 2.1.12 表达载体阳性克隆的筛选及验证 | 第36页 |
| 2.2 RNA干扰载体的构建 | 第36-38页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第36-37页 |
| 2.2.2 克隆载体的构建 | 第37页 |
| 2.2.3 RNA干扰中间载体pucc及阳性克隆质粒的酶切及回收 | 第37页 |
| 2.2.4 正向序列连接RNA干扰中间载体pucc | 第37页 |
| 2.2.5 与反向序列的连接 | 第37-38页 |
| 2.2.6 RNA干扰中间载体pucc与植物过表达载体pXQ的重组质粒酶切鉴定 | 第38页 |
| 2.2.7 植物过表达载体pXQ的连接 | 第38页 |
| 2.3 目的基因过表达及RNA干扰重组质粒转化农杆菌 | 第38-39页 |
| 2.3.1 制备农杆菌EHA105感受态细胞 | 第38页 |
| 2.3.2 重组质粒转化农杆菌EHA105感受态细胞 | 第38-39页 |
| 2.3.3 阳性菌落的鉴定 | 第39页 |
| 2.4 农杆菌介导的水稻遗传转化 | 第39-43页 |
| 2.4.1 日本晴水稻愈伤的诱导 | 第39-40页 |
| 2.4.2 水稻愈伤的培养及预培养 | 第40页 |
| 2.4.3 水稻愈伤的农杆菌侵染与共培养 | 第40页 |
| 2.4.4 共培养后的愈伤洗菌 | 第40-41页 |
| 2.4.5 抗性愈伤的筛选 | 第41页 |
| 2.4.6 日本晴水稻愈伤的分化 | 第41页 |
| 2.4.7 日本晴水稻愈伤的生根 | 第41页 |
| 2.4.8 炼苗和移栽 | 第41页 |
| 2.4.9 转基因水稻基因组DNA的提取 | 第41-42页 |
| 2.4.10 转基因植株的PCR检测 | 第42-43页 |
| 3 结果与分析 | 第43-51页 |
| 3.1 植物过表达载体构建 | 第43-45页 |
| 3.1.1 PCR扩增获得各目的基因的编码区 | 第43页 |
| 3.1.2 与各目的基因重组的植物表达载体pXQ酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 3.1.3 pXQ重组质粒转化农杆菌EHA105的菌液PCR鉴定 | 第44-45页 |
| 3.2 RNA干扰载体的构建 | 第45-48页 |
| 3.2.1 PCR扩增目的基因的RNA干扰正反向片段 | 第45-46页 |
| 3.2.2 RNA干扰反向重复序列的构建及连接植物过表达载体pXQ | 第46-47页 |
| 3.2.3 RNA干扰载体转化农杆菌及鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3 水稻遗传转化 | 第48-51页 |
| 3.3.1 水稻愈伤的诱导及培养 | 第48页 |
| 3.3.2 农杆菌的侵染、洗菌及筛选分化 | 第48-49页 |
| 3.3.3 抗性组培苗的诱导、生根及炼苗和移栽 | 第49-50页 |
| 3.3.4 转基因植株的PCR鉴定 | 第50-51页 |
| 4 小结与讨论 | 第51-52页 |
| 第四章 转基因植株表型观察与分析 | 第52-60页 |
| 1 实验材料及仪器 | 第52页 |
| 1.1 实验材料 | 第52页 |
| 1.2 实验试剂 | 第52页 |
| 1.3 主要仪器 | 第52页 |
| 2 实验方法 | 第52-54页 |
| 2.1 转基因植株表型观察 | 第52-53页 |
| 2.2 转基因水稻总RNA的提取和检测 | 第53页 |
| 2.3 cDNA的合成 | 第53页 |
| 2.4 qPCR反应 | 第53-54页 |
| 3 结果与分析 | 第54-59页 |
| 3.1 转基因水稻表型分析 | 第54-58页 |
| 3.2 过表达转基因水稻OsMET04表达量检测 | 第58-59页 |
| 4 小结与讨论 | 第59-60页 |
| 第五章 总结及展望 | 第60-62页 |
| 1 实验总结 | 第60-61页 |
| 2 实验展望 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-67页 |
| 附录一 实验中使用的载体 | 第67-68页 |
| 附录二 常用培养基及相关试剂的配制 | 第68-71页 |
| 附录三 转基因水稻培养基的配制 | 第71-75页 |
| 致谢 | 第75页 |
