| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 1 文献综述 | 第10-16页 |
| 1.1 溶藻弧菌的研究进展 | 第10-12页 |
| 1.1.1 溶藻弧菌的主要生物学特征 | 第10页 |
| 1.1.2 溶藻弧菌的致病因子 | 第10-12页 |
| 1.2 革兰氏阴性菌的蛋白分泌系统(ProteinSecretionSystem) | 第12页 |
| 1.3 溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统(TypeIIIsecretionsystem,T3SS) | 第12-14页 |
| 1.4 研究目的和意义 | 第14-16页 |
| 2 vscB和vscD基因的克隆及生物信息学分析 | 第16-28页 |
| 2.1 材料 | 第16页 |
| 2.1.1 载体及菌株 | 第16页 |
| 2.1.2 试剂 | 第16页 |
| 2.1.3 仪器 | 第16页 |
| 2.2 方法 | 第16-17页 |
| 2.2.1 溶藻弧菌HY9901菌株基因组的抽提 | 第16页 |
| 2.2.2 vscB和vscD基因的克隆 | 第16-17页 |
| 2.2.3 目的片段与载体的连接及测序 | 第17页 |
| 2.2.4 生物信息学分析方法 | 第17页 |
| 2.3 结果与分析 | 第17-26页 |
| 2.3.1 vscB和vscD基因的全长克隆 | 第17-18页 |
| 2.3.2 VscB和VscD的理化性质 | 第18-19页 |
| 2.3.3 VscB和VscD序列分析 | 第19-20页 |
| 2.3.4 同源性和进化分析 | 第20-23页 |
| 2.3.5 二级结构的预测 | 第23-24页 |
| 2.3.6 VscB和VscD的功能域预测 | 第24-25页 |
| 2.3.7 VscB和VscD三级结构 | 第25-26页 |
| 2.4 讨论 | 第26-28页 |
| 3 溶藻弧菌VscB和VscD的原核表达 | 第28-35页 |
| 3.1 材料 | 第28页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第28页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第28页 |
| 3.1.3 主要仪器 | 第28页 |
| 3.2 方法 | 第28-30页 |
| 3.2.1 构建重组表达质粒 | 第28-29页 |
| 3.2.2 融合蛋白的诱导表达 | 第29页 |
| 3.2.3 表达产物VscB和VscD蛋白的纯化 | 第29-30页 |
| 3.2.4 Westernblot检测 | 第30页 |
| 3.3 结果与分析 | 第30-34页 |
| 3.3.1 pET-28a-vscB和pET-32a-vscD表达载体的鉴定 | 第30-31页 |
| 3.3.2 pET-28a-vscB和pET-32a-vscD的诱导表达 | 第31-32页 |
| 3.3.3 表达产物VscB和VscD蛋白的可溶性分析 | 第32-33页 |
| 3.3.4 重组蛋白VscB和VscD蛋白的纯化检测 | 第33页 |
| 3.3.5 Westernblot检测 | 第33-34页 |
| 3.4 讨论 | 第34-35页 |
| 4 缺失株△vscB与回补株的构建 | 第35-44页 |
| 4.1 材料 | 第35-36页 |
| 4.1.1 质粒和菌株 | 第35-36页 |
| 4.1.2 引物 | 第36页 |
| 4.1.3 试剂 | 第36页 |
| 4.1.4 仪器 | 第36页 |
| 4.2 方法 | 第36-40页 |
| 4.2.1 △vscB的构建 | 第36-39页 |
| 4.2.2 回补株vscB的构建 | 第39-40页 |
| 4.3 结果与分析 | 第40-42页 |
| 4.3.1 vscB缺失片段的融合 | 第40-41页 |
| 4.3.2 pLP12-vscB重组质粒 | 第41页 |
| 4.3.3 第一次同源重组 | 第41页 |
| 4.3.4 第二次同源重组 | 第41-42页 |
| 4.3.5 回补株C-vscB构建 | 第42页 |
| 4.4 讨论 | 第42-44页 |
| 5 △vscB的生物学表型研究及免疫保护分析 | 第44-52页 |
| 5.1 材料 | 第44-45页 |
| 5.1.1 菌株和实验用鱼 | 第44页 |
| 5.1.2 仪器 | 第44页 |
| 5.1.3 试剂 | 第44-45页 |
| 5.2 方法 | 第45-46页 |
| 5.2.1 缺失株△vscB的遗传稳定性检测 | 第45页 |
| 5.2.2 测定细菌的生长曲线 | 第45页 |
| 5.2.3 细菌泳动实验 | 第45页 |
| 5.2.4 胞外蛋白酶活性测定 | 第45页 |
| 5.2.5 生物被膜测定 | 第45页 |
| 5.2.6 半数致死量的测定(LD50) | 第45-46页 |
| 5.2.7 免疫保护率的测定 | 第46页 |
| 5.2.8 统计学分析 | 第46页 |
| 5.3 结果与分析 | 第46-50页 |
| 5.3.1 缺失株△vscB的遗传稳定性 | 第46-47页 |
| 5.3.2 HY9901、△vscB和C-vscB的生长曲线 | 第47页 |
| 5.3.3 泳动实验 | 第47页 |
| 5.3.4 胞外蛋白酶活性测定 | 第47-48页 |
| 5.3.5 生物被膜测定 | 第48-50页 |
| 5.4 讨论 | 第50-52页 |
| 6 结论 | 第52-53页 |
| 6.1 溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscB和vscD基因的克隆 | 第52页 |
| 6.2 vscB和vscD表达载体的构建 | 第52页 |
| 6.3 缺失株△vscB的构建 | 第52页 |
| 6.4 缺失株△vscB生物学表型研究及免疫保护分析 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-62页 |
| 致谢 | 第62-63页 |
| 作者简介 | 第63-64页 |
| 导师简介 | 第64页 |
