| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 一、引言 | 第14-20页 |
| 1.1 植物体内磷吸收系统的动力学特征 | 第14页 |
| 1.2 高亲和磷转运蛋白 | 第14-17页 |
| 1.3 磷酸盐运输促进者PHF1 | 第17页 |
| 1.4 磷饥饿诱导的非编码RNAs | 第17-18页 |
| 1.5 应答低磷胁迫的转录因子 | 第18页 |
| 1.6 立题依据及研究意义 | 第18-20页 |
| 二、实验材料 | 第20-24页 |
| 2.1 植物材料 | 第20页 |
| 2.2 实验所用菌种及载体 | 第20页 |
| 2.3 实验所用的工具酶 | 第20页 |
| 2.4 化学试剂和其它材料 | 第20页 |
| 2.5 常用储存液 | 第20-22页 |
| 2.6 蛋白的原核表达和纯化所用的试剂及缓冲液 | 第22-23页 |
| 2.7 Western杂交所用试剂 | 第23页 |
| 2.8 EMSA所用试剂 | 第23页 |
| 2.9 仪器设备 | 第23-24页 |
| 三、实验方法 | 第24-43页 |
| 3.1 油菜无菌苗的培养及材料收取 | 第24页 |
| 3.2 油菜RNA的提取、纯化及逆转录 | 第24-25页 |
| 3.3 BnPht1；4的表达分析 | 第25-27页 |
| 3.3.1 设计引物 | 第25-26页 |
| 3.3.2 半定量PCR | 第26页 |
| 3.3.3 实时荧光定量PCR | 第26-27页 |
| 3.4 BnPht1；4的克隆及克隆载体的构建和测序 | 第27-31页 |
| 3.4.1 目的基因的获取 | 第28页 |
| 3.4.2 电泳检测PCR扩增结果 | 第28页 |
| 3.4.3 目的基因的回收 | 第28-29页 |
| 3.4.4 克隆载体的构建 | 第29页 |
| 3.4.5 连接产物转化感受态细胞DH5α | 第29页 |
| 3.4.6 阳性菌落的检测 | 第29-30页 |
| 3.4.7 质粒的大量提取 | 第30页 |
| 3.4.8 对目的基因进行测序 | 第30-31页 |
| 3.5 BnPht1；4过量表达载体的构建、拟南芥转化及鉴定 | 第31-34页 |
| 3.5.1 乙醇沉淀法回收酶切片段的步骤 | 第31-32页 |
| 3.5.2 质粒检测 | 第32页 |
| 3.5.3 质粒转化农杆菌 | 第32页 |
| 3.5.4 拟南芥种子的无菌处理、种植及转化 | 第32-33页 |
| 3.5.5 种子的收取及阳性苗的鉴定 | 第33-34页 |
| 3.6 BnPht1；4过量表达转基因拟南芥的功能分析 | 第34页 |
| 3.6.1 无机磷含量测定所需的试剂和实验步骤 | 第34页 |
| 3.6.2 花青素含量的测定方法 | 第34页 |
| 3.7 BnPht1；4启动子克隆、载体构建及拟南芥转化 | 第34-35页 |
| 3.8 组织化学法鉴定BnPht1；4P的转基因阳性苗 | 第35-36页 |
| 3.9 BnPht1；4P中P1BS元件突变载体构建、拟南芥的转化及鉴定 | 第36页 |
| 3.10 BnPht1；4-GFP融合表达载体的构建及亚细胞定位分析 | 第36-37页 |
| 3.11 WRKY75与BnPht1；4启动子相互作用的酵母单杂交实验 | 第37-39页 |
| 3.11.1 酵母Y1HGlod感受态细胞的制备 | 第37页 |
| 3.11.2 酵母转化 | 第37-39页 |
| 3.12 EMSA验证WRKY75与BnPht1；4启动子相互作用 | 第39-43页 |
| 3.12.1 感受态细胞BL21的制备 | 第39页 |
| 3.12.2 pMAL-WRKY75的蛋白表达 | 第39-40页 |
| 3.12.3 MBP-WRKY75融合蛋白表达纯化 | 第40页 |
| 3.12.4 Western杂交检测纯化的蛋白 | 第40-41页 |
| 3.12.5 MBP-WRKY75融合蛋白大量纯化 | 第41-42页 |
| 3.12.6 DNA探针的合成 | 第42页 |
| 3.12.7 非变性蛋白胶检测蛋白与DNA的结合 | 第42-43页 |
| 四、实验结果 | 第43-61页 |
| 4.1 油菜BnPht1；4基因克隆 | 第43页 |
| 4.2 BnPht1；4编码氨基酸序列分析 | 第43-44页 |
| 4.3 系统进化树分析BnPht1；4 | 第44-45页 |
| 4.4 油菜BnPht1；4蛋白的亚细胞定位及拓扑学结构 | 第45-46页 |
| 4.4.1 pBI-BnPht1；4-eGFP融合表达载体的构建 | 第45页 |
| 4.4.2 共聚焦显微镜观察BnPht1；4-eGFP融合蛋白的亚细胞定位 | 第45页 |
| 4.4.3 BnPht1；4蛋白的拓扑学结构预测 | 第45-46页 |
| 4.5 油菜基因BnPht1；4的表达模式分析 | 第46-48页 |
| 4.5.1 正常磷条件下BnPht1；4在油菜中的组织表达分析 | 第46-47页 |
| 4.5.2 低磷和恢复处理下BnPht1；4基因在油菜根中的表达情况 | 第47-48页 |
| 4.5.3 低磷条件下BnPht1；4基因在油菜根中的表达分析 | 第48页 |
| 4.6 低磷处理下BnPht1；4启动子活性分析 | 第48-51页 |
| 4.6.1 BnPht1；4启动子克隆 | 第48-49页 |
| 4.6.2 BnPht1；4启动子的序列分析 | 第49页 |
| 4.6.3 载体pBI101-BnPht1；4P-GUS的构建和拟南芥转化 | 第49-50页 |
| 4.6.4 转基因拟南芥GUS活性分析 | 第50-51页 |
| 4.7 过量表达BnPht1；4影响拟南芥根的形态 | 第51-54页 |
| 4.7.1 油菜BnPht1；4基因过量表达载体构建及拟南芥遗传转化 | 第51页 |
| 4.7.2 过量表达BnPht1；4转基因拟南芥阳性苗的鉴定 | 第51-52页 |
| 4.7.3 过量表达BnPht1；4转基因拟南芥的表型分析 | 第52-54页 |
| 4.7.4 OEBnPht1；4经低磷下诱导后花青素含量的测定 | 第54页 |
| 4.8 BnPht1；4启动子P1BS结合元件突变后活性分析 | 第54-56页 |
| 4.8.1 载体构建和拟南芥转化 | 第54-55页 |
| 4.8.2 BnPht1；4启动子P1BS结合元件突变后GUS活性分析 | 第55-56页 |
| 4.9 WRKY75与BnPht1；4P相互作用的酵母单杂交和EMSA分析 | 第56-61页 |
| 4.9.1 pAbAi-BnPht1；4P和pGADT7-WRKY75载体的构建 | 第56页 |
| 4.9.2 pAbAi-BnPht1；4P与pGADT7-WRKY75相互作用的酵母单杂交试验 | 第56-57页 |
| 4.9.3 原核表达载体pMAL-WRKY75的构建及感受态细胞BL21的转化 | 第57页 |
| 4.9.4 MBP-WRKY75融合蛋白表达 | 第57-58页 |
| 4.9.5 Western杂交检测原核表达蛋白WRKY75 | 第58页 |
| 4.9.6 DNA探针的制备和非变性聚丙烯酰胺凝胶检测纯化的蛋白 | 第58-59页 |
| 4.9.7 EMSA实验验证WRKY75蛋白与BnPht1；4P的相互作用 | 第59-61页 |
| 五、讨论 | 第61-64页 |
| 参考文献 | 第64-69页 |
| 附录 | 第69-70页 |
| 硕士期间发表的论文 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71页 |
