| 摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 文献综述 | 第12-21页 |
| 第一章 Nanog 的研究进展 | 第12-21页 |
| 1.1 Nanog 的结构及转录活性 | 第13页 |
| 1.2 Nanog 参与了ES 细胞中多种主要的转录以及调控网络 | 第13-14页 |
| 1.3. Nanog 的表达调控及与其他各种外源因子的关系 | 第14-17页 |
| 1.3.1 Nanog 的表达与调控 | 第14-17页 |
| 1.3.2 Nanog 与其他外源因子的协同作用 | 第17页 |
| 1.4 Nanog 与ES 细胞中调控因子的相互作用信号通路 | 第17-18页 |
| 1.5 Nanog 参与细胞核重编程 | 第18-20页 |
| 1.6 Nanog 与各种肿瘤的关系 | 第20页 |
| 1.7 问题与展望 | 第20页 |
| 1.8 本研究的目的及主要研究内容 | 第20-21页 |
| 实验研究 | 第21-48页 |
| 第二章 人Nanog 基因的克隆及其在CHO-K1 细胞中的表达 | 第21-35页 |
| 2.1 材料 | 第21-23页 |
| 2.1.1 引物合成及序列测定 | 第21页 |
| 2.1.2 菌株、细胞株和质粒提取 | 第21-22页 |
| 2.1.3 分子生物学工具酶以及其它化学试剂 | 第22页 |
| 2.1.4 各种常用分子生物学试剂盒 | 第22页 |
| 2.1.5 各种细胞培养试剂 | 第22页 |
| 2.1.6 电泳试剂 | 第22页 |
| 2.1.7 抗体 | 第22-23页 |
| 2.1.8 主要实验仪器 | 第23页 |
| 2.2 方法 | 第23-30页 |
| 2.2.1 表达载体的建立 | 第23-24页 |
| 2.2.2 细胞总RNA 的提取及进行RT-PCR | 第24页 |
| 2.2.3 hNanog 基因的RT-PCR 扩增 | 第24-26页 |
| 2.2.4 PCR 的产物回收方法 | 第26页 |
| 2.2.5 pcDNA3.1-hNanog 表达载体的构建与鉴定 | 第26-27页 |
| 2.2.6 哺乳动物细胞的转染 | 第27页 |
| 2.2.7 稳定转染克隆的筛选 | 第27-28页 |
| 2.2.8 实时荧光定量PCR | 第28页 |
| 2.2.9 hNanog 表达的Western blot 分析 | 第28-30页 |
| 2.3 结果 | 第30-33页 |
| 2.3.1 RT-PCR 扩增人Nanog 基因 | 第30页 |
| 2.3.2 细胞系pcDNA3.1(+)-hNanog 表达载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.3.3 稳定转染有hNanog 的CHO-K1 细胞系的筛选 | 第31-32页 |
| 2.3.4 Realtime-PCR 检测转入的hNanog 基因的转录 | 第32页 |
| 2.3.5 hNanog 基因表达的western-blot 检测 | 第32-33页 |
| 2.4 讨论 | 第33-34页 |
| 2.5 小结 | 第34-35页 |
| 第三章 荧光定量PCR 检测人Nanog 对Smad3,Wnt3 和c-Jun 的调控 | 第35-40页 |
| 3.1 材料 | 第35-36页 |
| 3.1.1 引物合成及序列测定 | 第35页 |
| 3.1.2 细胞株和各种分子工具载体 | 第35页 |
| 3.1.3 常用分子生物学试剂盒 | 第35页 |
| 3.1.4 细胞培养试剂 | 第35-36页 |
| 3.1.5 主要实验仪器 | 第36页 |
| 3.2 方法 | 第36-38页 |
| 3.2.1 哺乳动物细胞的培养 | 第36页 |
| 3.2.2 细胞总RNA 的提取 | 第36页 |
| 3.2.3 RNA 中的微量DNA 的去除 | 第36-37页 |
| 3.2.4 RT-PCR | 第37页 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR 引物设计 | 第37页 |
| 3.2.6 Realtime-PCR 检测Smad3,Wnt3,c-Jun 基因的转录 | 第37-38页 |
| 3.3 结果 | 第38页 |
| 3.4 讨论 | 第38-39页 |
| 3.5 小结 | 第39-40页 |
| 第四章 荧光素报告系统检测人Nanog 对Smad3 的调控 | 第40-48页 |
| 4.1 材料 | 第40-41页 |
| 4.1.1 引物合成及序列测定 | 第40页 |
| 4.1.2 菌株、细胞株和质粒 | 第40页 |
| 4.1.3 分子生物学工具酶及其它化学试剂 | 第40页 |
| 4.1.4 常用分子生物学试剂盒 | 第40-41页 |
| 4.1.5 细胞培养试剂 | 第41页 |
| 4.1.6 主要实验仪器 | 第41页 |
| 4.2 方法 | 第41-43页 |
| 4.2.1 细胞的复苏 | 第41页 |
| 4.2.2 PGL-3BASIC-SMAD3-3K 的质粒构建与鉴定 | 第41-42页 |
| 4.2.3 PGL-3BASIC-SMAD3-8K 表达载体的构建与鉴定 | 第42页 |
| 4.2.4 根据样品增设对照组和实验组 | 第42页 |
| 4.2.5 哺乳动物细胞的转染 | 第42-43页 |
| 4.2.6 Luciferase 双荧光素酶报告检测 | 第43页 |
| 4.3 结果 | 第43-47页 |
| 4.3.1 PGL-3BASIC-SMAD3-3K 载体的构建与筛选 | 第43-44页 |
| 4.3.2 PGL-3BASIC-SMAD3-3K 阳性克隆的酶切鉴定 | 第44页 |
| 4.3.3 PGL-3BASIC-SMAD3-3K 的双荧光报告基因检测 | 第44-45页 |
| 4.3.4 PGL-3BASIC-SMAD3-8K 载体的构建与筛选 | 第45页 |
| 4.3.5 PGL-3BASIC-SMAD3-8K 的 PCR 鉴定 | 第45-46页 |
| 4.3.6 PGL-3BASIC-SMAD3-8Kd 荧光素酶报告基因检测 | 第46-47页 |
| 4.4 讨论 | 第47页 |
| 4.5 小结 | 第47-48页 |
| 结论 | 第48-49页 |
| 参考文献 | 第49-56页 |
| 致谢 | 第56-57页 |
| 作者简介 | 第57页 |
