| 中文摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 符号说明 | 第8-9页 |
| 目录 | 第9-15页 |
| 第一章 文献综述 | 第15-34页 |
| 1 流感病毒概述 | 第15-33页 |
| 1.1 流行病学特点 | 第16-17页 |
| 1.2 公共卫生意义 | 第17-18页 |
| 1.3 甲型流感病毒病原学及生物学特性 | 第18-19页 |
| 1.4 流感分子生物学特征 | 第19-22页 |
| 1.4.1 血凝素基因HA | 第19-20页 |
| 1.4.2 神经氨酸酶基因NA | 第20页 |
| 1.4.3 核蛋白基因NP | 第20-21页 |
| 1.4.4 聚合酶基因PA、PB1、PB2 | 第21页 |
| 1.4.5 基质蛋白基因M | 第21页 |
| 1.4.6 非结构蛋白基因NS | 第21-22页 |
| 1.5 流感病毒的抗原性变异 | 第22-23页 |
| 1.6 流感病毒免疫学机制 | 第23-25页 |
| 1.7 流感实验室诊断技术 | 第25-28页 |
| 1.7.1 病毒分离 | 第25-26页 |
| 1.7.2 血清学诊断 | 第26-28页 |
| 1.7.3 分子生物学诊断 | 第28页 |
| 1.8 流感病毒致病机制的研究 | 第28-29页 |
| 1.9 流感病毒反向遗传技术的研究进展 | 第29-32页 |
| 1.10 疫苗研究进展 | 第32-33页 |
| 2 本研究的意义及目的 | 第33-34页 |
| 第二章 H1N1亚型大熊猫流感病毒的分离鉴定以及遗传进化分析 | 第34-58页 |
| 1 材料与方法 | 第34-42页 |
| 1.1 实验材料 | 第34-35页 |
| 1.1.1 病料和实验动物 | 第34页 |
| 1.1.2 鸡胚、细胞及载体 | 第34页 |
| 1.1.3 主要试剂 | 第34-35页 |
| 1.1.4 主要仪器及设备 | 第35页 |
| 1.2 实验方法 | 第35-42页 |
| 1.2.1 病毒的分离及纯化 | 第35-36页 |
| 1.2.2 病毒分离物的鉴定 | 第36-38页 |
| 1.2.3 病毒特性研究 | 第38页 |
| 1.2.4 动物回归试验 | 第38-39页 |
| 1.2.5 流感病毒全基因组序列扩增于遗传进化分析 | 第39-42页 |
| 2 结果与分析 | 第42-54页 |
| 2.1 病毒分离及传代 | 第42-43页 |
| 2.2 病毒血凝特性、特异性及亚型初步鉴定 | 第43页 |
| 2.3 病毒命名 | 第43页 |
| 2.4 病毒致MDCK细胞病变进程及病毒感染动力学 | 第43-44页 |
| 2.5 病毒特性研究 | 第44-45页 |
| 2.5.1 EID50测定结果 | 第44-45页 |
| 2.5.2 TCID50测定结果 | 第45页 |
| 2.6 动物回归实验结果 | 第45-46页 |
| 2.7 流感病毒全基因序列测定与遗传进化分析 | 第46-54页 |
| 2.7.1 流感病毒基因组RT-PCR扩增结果 | 第46-47页 |
| 2.7.2 遗传进化分析结果 | 第47-54页 |
| 3 讨论 | 第54-56页 |
| 3.1 病毒的分离鉴定 | 第54-55页 |
| 3.2 病毒生物学特性 | 第55页 |
| 3.3 流感病毒的全基因组序列分析 | 第55-56页 |
| 4 小结 | 第56-58页 |
| 第三章 大熊猫流感病毒A/Panda/Sichuan/9/2011(H1N1)八质粒反向遗传系统的构建 | 第58-83页 |
| 1 材料与仪器 | 第58-59页 |
| 1.1 质粒、细胞以及鸡胚等 | 第58页 |
| 1.2 限制性内切酶 | 第58页 |
| 1.3 仪器 | 第58-59页 |
| 2 实验方法 | 第59-72页 |
| 2.1 三个聚合酶基因的连接 | 第59-62页 |
| 2.1.1 连接引物的设计 | 第59页 |
| 2.1.2 六个片段的PCR扩增 | 第59页 |
| 2.1.3 PCR产物的回收与纯化 | 第59-60页 |
| 2.1.4 扩增基因磷酸化 | 第60页 |
| 2.1.5 纯化PCR产物与pMD1 8-T载体的连接 | 第60页 |
| 2.1.6 感受态细胞的制备 | 第60页 |
| 2.1.7 连接产物转化感受态细胞 | 第60页 |
| 2.1.8 重组质粒的筛选 | 第60-61页 |
| 2.1.9 质粒鉴定 | 第61页 |
| 2.1.10 各重组载体的酶切 | 第61页 |
| 2.1.11 酶切产物片段回收 | 第61-62页 |
| 2.1.12 目标片段和重组质粒的再连接 | 第62页 |
| 2.1.13 连接重组载体的转化 | 第62页 |
| 2.1.14 完整基因重组质粒双酶切鉴定 | 第62页 |
| 2.1.15 测序及其序列分析 | 第62页 |
| 2.2 含BSPQI酶切位点的全基因T载体克隆 | 第62-67页 |
| 2.2.1 技术路线 | 第62-64页 |
| 2.2.2 全基因扩增 | 第64-65页 |
| 2.2.3 全基因克隆 | 第65-66页 |
| 2.2.4 全基因转化质粒的鉴定 | 第66-67页 |
| 2.3 八质粒共转染系统的构建 | 第67-70页 |
| 2.3.1 八个pMD18-T重组载体和PBD载体的酶切 | 第67-68页 |
| 2.3.2 酶切产物的回收与纯化 | 第68页 |
| 2.3.3 纯化酶切产物与PBD载体的连接 | 第68页 |
| 2.3.4 感受态细胞的制备 | 第68页 |
| 2.3.5 连接产物转化感受态细胞 | 第68页 |
| 2.3.6 重组质粒的筛选 | 第68-69页 |
| 2.3.7 全基因转化质粒的PCR鉴定 | 第69页 |
| 2.3.8 酶切鉴定 | 第69-70页 |
| 2.4 重组质粒的测序 | 第70页 |
| 2.5 PB2基因点突变 | 第70页 |
| 2.6 测序结果的生物信息学分析 | 第70页 |
| 2.7 病毒的拯救 | 第70-72页 |
| 2.7.1 质粒准备 | 第70页 |
| 2.7.2 转染细胞准备 | 第70-71页 |
| 2.7.3 八质粒共转染 | 第71页 |
| 2.7.4 转染细胞上清液感染MDCK细胞 | 第71页 |
| 2.7.5 接种鸡胚 | 第71-72页 |
| 2.7.6 病毒鉴定 | 第72页 |
| 3. 实验结果 | 第72-80页 |
| 3.1. 三个聚合酶基因的连接 | 第72-75页 |
| 3.1.1 六个待连接片段的PCR扩增 | 第72-73页 |
| 3.1.2 重组后的质粒酶切鉴定 | 第73页 |
| 3.1.3 再重组质粒的鉴定 | 第73-75页 |
| 3.2 含BspQ酶切位点的全基因T载体克隆 | 第75-76页 |
| 3.2.1 全基因组序列的扩增 | 第75-76页 |
| 3.2.2 重组质粒的酶切的酶切鉴定 | 第76页 |
| 3.3 八质粒共转染载体的构建 | 第76-78页 |
| 3.3.1 双向表达载体的电泳鉴定 | 第76-77页 |
| 3.3.2 双向表达载体pBD的酶切结果 | 第77页 |
| 3.3.3 重组质粒的酶切鉴定 | 第77页 |
| 3.3.4 全基因序列分析 | 第77-78页 |
| 3.4 病毒拯救 | 第78-80页 |
| 3.4.1 病毒在293T细胞上的病变 | 第78页 |
| 3.4.2 病毒在MDCK细胞上的病变 | 第78-79页 |
| 3.4.3 血凝及血凝抑制实验 | 第79页 |
| 3.4.4 电镜实验 | 第79-80页 |
| 3.4.5 PCR检测结果 | 第80页 |
| 4 讨论 | 第80-82页 |
| 4.1 关于流感病毒反向遗传技术的应用 | 第80-81页 |
| 4.2 关于共转染质粒的准备 | 第81页 |
| 4.3 关于细胞的准备和八质粒共转染实验 | 第81-82页 |
| 4.4 关于反向遗传操作技术所涉及的生物安全问题 | 第82页 |
| 5 小结 | 第82-83页 |
| 第四章 M2e和HA基因融合表达重组质粒免疫效力研究 | 第83-98页 |
| 1 材料及方法 | 第83-87页 |
| 1.1 实验材料 | 第83-84页 |
| 1.1.1 毒株、菌株及载体 | 第83页 |
| 1.1.2 实验动物 | 第83页 |
| 1.1.3 主要试剂 | 第83-84页 |
| 1.1.4 主要仪器 | 第84页 |
| 1.2 实验方法 | 第84-87页 |
| 1.2.1 引物的设计与合成 | 第84-85页 |
| 1.2.2 真核表达载体的构建 | 第85页 |
| 1.2.3 重组真核表达载体在Vero细胞中的转录表达研究 | 第85-86页 |
| 1.2.4 重组质粒免疫效力研究 | 第86-87页 |
| 1.2.7 攻毒保护实验 | 第87页 |
| 1.2.8 统计学方法 | 第87页 |
| 2 实验结果 | 第87-94页 |
| 2.1 pM2HA的构建 | 第87-88页 |
| 2.2 pM2HA的转录及表达研究 | 第88-89页 |
| 2.4 重组质粒免疫效力研究 | 第89-91页 |
| 2.4.1 体液免疫 | 第89-90页 |
| 2.4.2 细胞免疫 | 第90-91页 |
| 2.5 重组质粒免疫保护研究 | 第91-94页 |
| 2.5.1 攻毒后存活率及体重变化 | 第91-92页 |
| 2.5.2 免疫保护对中等剂量攻毒后组织病变程度影响 | 第92-93页 |
| 2.5.3 对异源病毒攻击的保护 | 第93-94页 |
| 3 讨论 | 第94-97页 |
| 3.1 HA基因的选择 | 第94页 |
| 3.2 HA和M2e基因的联用 | 第94-95页 |
| 3.3 重组质粒的表达及免疫效果 | 第95-97页 |
| 4 小结 | 第97-98页 |
| 全文总结论 | 第98-99页 |
| 本研究的创新点 | 第99-100页 |
| 参考文献 | 第100-115页 |
| 致谢 | 第115-116页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第116页 |
