| 致谢 | 第5-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩写简表 | 第11-12页 |
| 目录 | 第12-18页 |
| 1 文献综述 | 第18-47页 |
| 1.1 生物质 | 第18-21页 |
| 1.1.1 可再生资源与生物质概述 | 第18-19页 |
| 1.1.2 木质纤维素的构成 | 第19页 |
| 1.1.3 纤维素 | 第19-20页 |
| 1.1.4 生物燃料 | 第20-21页 |
| 1.1.5 生物质资源的利用 | 第21页 |
| 1.2 纤维素酶概述 | 第21-25页 |
| 1.2.1 纤维素酶系的组成及协同作用 | 第22-24页 |
| 1.2.2 纤维素酶的结构与催化机制 | 第24-25页 |
| 1.3 纤维素酶的研究现状 | 第25-32页 |
| 1.3.1 丝状真菌纤维素酶表达调控的研究 | 第25-26页 |
| 1.3.2 纤维素酶基因的异源表达 | 第26-27页 |
| 1.3.3 纤维素酶系中酶组分的重组 | 第27-29页 |
| 1.3.4 通过蛋白质工程改造纤维素酶 | 第29-32页 |
| 1.4 酶的定向进化 | 第32-41页 |
| 1.4.1 定向进化的背景与原理 | 第32-33页 |
| 1.4.2 突变体库的构建方法 | 第33-35页 |
| 1.4.3 高通量筛选方法 | 第35-38页 |
| 1.4.4 纤维素酶的定向进化 | 第38-41页 |
| 1.5 多基因共表达研究现状 | 第41-45页 |
| 1.5.1 多质粒共转化系统 | 第41-42页 |
| 1.5.2 多顺反子系统 | 第42-43页 |
| 1.5.3 多启动子系统 | 第43-45页 |
| 1.6 课题研究的内容与意义 | 第45-47页 |
| 2 纤维素酶的克隆及诱导表达 | 第47-65页 |
| 2.1 材料 | 第47-49页 |
| 2.1.1 菌种与质粒 | 第47页 |
| 2.1.2 工具酶 | 第47-48页 |
| 2.1.3 试剂 | 第48页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第48-49页 |
| 2.2 实验方法 | 第49-61页 |
| 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳 | 第49页 |
| 2.2.2 里氏木霉基因组提取 | 第49页 |
| 2.2.3 粪肥纤维单胞菌基因组提取 | 第49-50页 |
| 2.2.4 质粒的提取 | 第50页 |
| 2.2.5 目的基因的扩增 | 第50-53页 |
| 2.2.6 基因的纯化、酶切以及与载体的连接 | 第53-55页 |
| 2.2.7 大肠杆菌BL21(DE3)普通感受态的制备以及转化 | 第55-56页 |
| 2.2.8 重组子的鉴定 | 第56页 |
| 2.2.9 目标蛋白的诱导表达及处理 | 第56-57页 |
| 2.2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳 | 第57-58页 |
| 2.2.11 Bradford法测定蛋白浓度 | 第58-59页 |
| 2.2.12 目标蛋白的纯化 | 第59-61页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第61-64页 |
| 2.3.1 目的基因的扩增 | 第61页 |
| 2.3.2 目的基因的克隆 | 第61-62页 |
| 2.3.3 目的蛋白的诱导表达和纯化 | 第62-64页 |
| 2.3.4 蛋白浓度标准曲线 | 第64页 |
| 2.4 本章小结 | 第64-65页 |
| 3 共表达质粒的构建 | 第65-90页 |
| 3.1 实验材料 | 第65-67页 |
| 3.1.1 菌种与质粒 | 第65-66页 |
| 3.1.2 工具酶 | 第66页 |
| 3.1.3 试剂 | 第66页 |
| 3.1.4 主要仪器 | 第66-67页 |
| 3.2 实验方法 | 第67-82页 |
| 3.2.1 双顺反子表达盒构建方法 | 第67页 |
| 3.2.2 构建源于pET30a的生物砖质粒 | 第67-72页 |
| 3.2.3 质粒的构建 | 第72-79页 |
| 3.2.4 蛋白表达与纯化 | 第79-81页 |
| 3.2.5 目标蛋白酶活测定 | 第81-82页 |
| 3.2.6 酶反应特性测定 | 第82页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第82-88页 |
| 3.3.1 质粒的构建 | 第82-83页 |
| 3.3.2 XYN和BGL共表达的情况 | 第83-85页 |
| 3.3.3 酶活的比较 | 第85-88页 |
| 3.3.4 酶的特性 | 第88页 |
| 3.4 本章小结 | 第88-90页 |
| 4 纤维素酶系在大肠杆菌中的构建 | 第90-109页 |
| 4.1 实验材料 | 第91-92页 |
| 4.1.1 菌种与质粒 | 第91页 |
| 4.1.2 工具酶 | 第91页 |
| 4.1.3 试剂 | 第91-92页 |
| 4.1.4 主要仪器 | 第92页 |
| 4.2 实验方法 | 第92-102页 |
| 4.2.1 单顺反子质粒的构建 | 第92-94页 |
| 4.2.2 多启动子表达盒的构建 | 第94-97页 |
| 4.2.3 多顺反子质粒的构建 | 第97-100页 |
| 4.2.4 蛋白表达与纯化 | 第100-102页 |
| 4.2.5 酶活的测定 | 第102页 |
| 4.3 实验结果与讨论 | 第102-108页 |
| 4.3.1 P1-P9菌株中纤维素酶的表达与纯化 | 第102-104页 |
| 4.3.2 共表达纤维素酶产还原糖的能力 | 第104-105页 |
| 4.3.3 CbhA,CenA和BGL降解纤维素产葡萄糖的能力 | 第105-106页 |
| 4.3.4 CbhA与BGL之间的协同作用 | 第106页 |
| 4.3.5 CenA与BGL之间的协同作用 | 第106-107页 |
| 4.3.6 共表达的纤维素酶系混合物产葡萄糖的情况 | 第107-108页 |
| 4.4 本章小结 | 第108-109页 |
| 5 内切酶和p-葡萄糖苷酶的共定向进化 | 第109-126页 |
| 5.1 实验材料 | 第110-112页 |
| 5.1.1 菌种与质粒 | 第110-111页 |
| 5.1.2 工具酶 | 第111页 |
| 5.1.3 试剂 | 第111页 |
| 5.1.4 主要仪器 | 第111-112页 |
| 5.2 实验步骤 | 第112-119页 |
| 5.2.1 大肠杆菌BL21(DE3)超级感受态的制备 | 第112-113页 |
| 5.2.2 双顺反子表达质粒的构建 | 第113页 |
| 5.2.3 突变体文库的构建 | 第113-114页 |
| 5.2.4 内切酶和β-葡萄糖苷酶的诱导表达 | 第114-115页 |
| 5.2.5 高通量筛选方法的建立 | 第115页 |
| 5.2.6 CenA和BGL突变体的亚克隆及诱导表达 | 第115-117页 |
| 5.2.7 重组突变体A12-H1的构建 | 第117-118页 |
| 5.2.8 阳性突变体的表达与纯化 | 第118页 |
| 5.2.9 酶活的测定 | 第118-119页 |
| 5.3 实验结果与讨论 | 第119-124页 |
| 5.3.1 突变体库的构建 | 第119页 |
| 5.3.2 第一轮筛选结果 | 第119-120页 |
| 5.3.3 第二轮筛选结果 | 第120-122页 |
| 5.3.4 第三轮筛选结果 | 第122-124页 |
| 5.3.5 重组突变体A12-H1的构建及诱导表达 | 第124页 |
| 5.4 本章小结 | 第124-126页 |
| 6 外切酶的定向进化 | 第126-138页 |
| 6.1 实验材料 | 第126-128页 |
| 6.1.1 菌种与质粒 | 第126页 |
| 6.1.2 工具酶 | 第126-127页 |
| 6.1.3 试剂 | 第127-128页 |
| 6.1.4 主要仪器 | 第128页 |
| 6.2 实验步骤 | 第128-134页 |
| 6.2.1 大肠杆菌BL21(DE3)超级感受态的制备 | 第128页 |
| 6.2.2 CbhA与BGL双顺反子质粒p cbhA-bgl的构建 | 第128-129页 |
| 6.2.3 突变体文库的构建 | 第129-131页 |
| 6.2.4 外切酶和β-葡萄糖苷酶的诱导表达 | 第131页 |
| 6.2.5 高通量筛选方法的建立 | 第131-132页 |
| 6.2.6 CbhA突变体的亚克隆及诱导表达 | 第132-133页 |
| 6.2.7 纤维素酶系阳性突变体共表达载体的构建 | 第133页 |
| 6.2.8 阳性突变体蛋白的表达与纯化及SDS-PAGE电泳检测 | 第133页 |
| 6.2.9 酶活的测定 | 第133-134页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第134-136页 |
| 6.3.1 突变体库的构建 | 第134页 |
| 6.3.2 筛选结果 | 第134页 |
| 6.3.3 蛋白表达与纯化 | 第134-135页 |
| 6.3.4 突变体活性分析 | 第135-136页 |
| 6.3.5 CbhA、CenA和BGL阳性突变体的整合 | 第136页 |
| 6.4 本章小结 | 第136-138页 |
| 7 结论与展望 | 第138-142页 |
| 7.1 结论 | 第138-140页 |
| 7.2 展望 | 第140-142页 |
| 参考文献 | 第142-155页 |
| 攻读博士学位期间主要研究成果 | 第155页 |
