| 摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫学研究进展 | 第16-56页 |
| 1 病原学 | 第16-23页 |
| 1.1 病毒基因组结构和亚基因组mRNA | 第16-18页 |
| 1.2 病毒非结构蛋白 | 第18-20页 |
| 1.3 病毒结构蛋白 | 第20-22页 |
| 1.3.1 病毒粒子及N蛋白 | 第20页 |
| 1.3.2 主要外膜蛋白 | 第20-22页 |
| 1.3.3 次要外膜蛋白 | 第22页 |
| 1.4 病毒生物学特性 | 第22-23页 |
| 2 免疫学 | 第23-33页 |
| 2.1 宿主抗病毒感染免疫应答 | 第23-24页 |
| 2.2 机体对PRRSV的先天性免疫应答 | 第24-26页 |
| 2.2.1 PRRSV对干扰素诱导的干扰作用 | 第24页 |
| 2.2.2 PRRSV编码蛋白对IFN诱导和激活信号的抑制 | 第24-25页 |
| 2.2.3 毒株和细胞对干扰素诱导的影响 | 第25-26页 |
| 2.3 获得性免疫应答 | 第26-30页 |
| 2.3.1 体液免疫反应 | 第26-29页 |
| 2.3.2 细胞介导的免疫应答 | 第29-30页 |
| 2.4 调节性T细胞与PRRSV | 第30-33页 |
| 2.4.1 Tregs的背景 | 第30页 |
| 2.4.2 病毒介导的Tregs活性 | 第30-31页 |
| 2.4.3 猪Tregs的表型和分布 | 第31页 |
| 2.4.4 猪Tregs抑制机制和目标 | 第31-32页 |
| 2.4.5 Tregs与PRRSV | 第32-33页 |
| 3 疫苗 | 第33-34页 |
| 4 结论和展望 | 第34-36页 |
| 参考文献 | 第36-56页 |
| 第二章 我国出现猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3部分基因缺失的新毒株 | 第56-80页 |
| 1 材料与方法 | 第57-63页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第57页 |
| 1.2 PAMs分离与培养 | 第57页 |
| 1.3 病毒分离 | 第57页 |
| 1.4 引物设计 | 第57-59页 |
| 1.5 RNA提取及RT-PCR扩增 | 第59-60页 |
| 1.6 PCR产物的纯化与回收。 | 第60-61页 |
| 1.7 PCR回收产物的克隆与转化 | 第61页 |
| 1.8 重组质粒的提取 | 第61-62页 |
| 1.9 重组质粒的鉴定和测序 | 第62页 |
| 1.10 核苷酸和aa序列分析 | 第62-63页 |
| 2 结果 | 第63-73页 |
| 2.1 病毒的分离 | 第63页 |
| 2.2 RT-PCR扩增及全基因组测序 | 第63-64页 |
| 2.3 全基因组序列比对和分析 | 第64-66页 |
| 2.4 系统进化分析 | 第66-70页 |
| 2.5 病毒基因重组分析 | 第70页 |
| 2.6 UTRs基因序列分析 | 第70-71页 |
| 2.7 GP3推导的氨基酸序列比对分析 | 第71-72页 |
| 2.8 GP5推导的氨基酸序列比对分析 | 第72-73页 |
| 3 讨论 | 第73-75页 |
| 参考文献 | 第75-80页 |
| 第三章 不同毒力美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs能力的比较 | 第80-96页 |
| 1 材料和方法 | 第81-84页 |
| 1.1 材料 | 第81页 |
| 1.1.1 细胞和病毒 | 第81页 |
| 1.1.2 试剂 | 第81页 |
| 1.2 猪PBMCs的分离 | 第81-82页 |
| 1.3 MoDCs细胞的培养 | 第82页 |
| 1.4 HP-PRRSV对PBMCs的感染 | 第82页 |
| 1.5 不同PRRSV毒株对MoDCs的感染 | 第82-83页 |
| 1.6 抗体标记及流式检测 | 第83页 |
| 1.7 CD4~+CD25~(high)细胞的分选 | 第83页 |
| 1.8 抑制活性测定 | 第83-84页 |
| 1.9 细胞因子测定 | 第84页 |
| 1.10 数据分析 | 第84页 |
| 2 结果 | 第84-89页 |
| 2.1 MoDCs的培养 | 第84-85页 |
| 2.2 PRRSV感染共培养系统对Tregs的诱导作用 | 第85-86页 |
| 2.3 Tregs的抑制功能检测 | 第86-87页 |
| 2.4 不同毒力PRRSV毒株对Tregs的诱导 | 第87-88页 |
| 2.5 细胞因子TGF-β和IL-10的测定 | 第88-89页 |
| 3 讨论 | 第89-91页 |
| 参考文献 | 第91-96页 |
| 第四章 核衣壳蛋白第15N和46Raa残基在高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒诱导Tregs细胞中的作用 | 第96-128页 |
| 1 材料与方法 | 第97-111页 |
| 1.1 材料 | 第97-99页 |
| 1.1.1 细胞和病毒 | 第97页 |
| 1.1.2 试剂 | 第97-98页 |
| 1.1.3 合成肽 | 第98-99页 |
| 1.2 表达PRRSV结构蛋白重组杆状病毒的构建 | 第99-104页 |
| 1.2.1 PRRSV结构蛋白基因片段克隆引物设计和合成 | 第99-100页 |
| 1.2.2 目的片段扩增及重组pFastBac Dual载体的获得 | 第100页 |
| 1.2.3 重组质粒的酶切和测序鉴定 | 第100-101页 |
| 1.2.4 重组Bacmid的构建与鉴定 | 第101-103页 |
| 1.2.5 重组杆状病毒的获得与扩增 | 第103页 |
| 1.2.6 重组结构蛋白杆状病毒的表达与Western Blot鉴定 | 第103-104页 |
| 1.2.7 重组杆状病毒表达蛋白的纯化 | 第104页 |
| 1.3 PRRSV N蛋白基因点突变毒株全长cDNA克隆的构建 | 第104-110页 |
| 1.3.1 BB0907全长cDNA克隆质粒pCMV-BB的构建 | 第104-108页 |
| 1.3.2 BB0907毒株相关点突变毒株cDNA全长克隆的构建 | 第108-110页 |
| 1.4 重组病毒的拯救 | 第110页 |
| 1.5 病毒蚀斑检测 | 第110页 |
| 1.6 病毒生长曲线测定 | 第110页 |
| 1.7 猪Tregs细胞诱导试验 | 第110-111页 |
| 1.8 流式方法检测Tregs细胞 | 第111页 |
| 1.9 细胞因子测定 | 第111页 |
| 1.10 数据分析 | 第111页 |
| 2 结果 | 第111-119页 |
| 2.1 HP-PRRSV结构蛋白重组杆状病毒的构建及表达 | 第111-114页 |
| 2.1.1 目的片段扩增及重组pFastBac Dual载体的构建 | 第111-112页 |
| 2.1.2 重组Bacmid的鉴定 | 第112-113页 |
| 2.1.3 重组杆状病毒的获得及目的基因表达 | 第113页 |
| 2.1.4 重组杆状病毒表达蛋白的纯化 | 第113-114页 |
| 2.2 重组蛋白诱导Tregs细胞的检测 | 第114页 |
| 2.3 不同毒力PRRSV毒株N蛋白诱导Tregs能力比较 | 第114-116页 |
| 2.4 N蛋白合成肽诱导Tregs细胞的检测 | 第116页 |
| 2.5 合成肽突变体诱导Tregs细胞的检测 | 第116-118页 |
| 2.6 PRRSVN蛋白基因突变毒株的构建 | 第118-119页 |
| 2.7 重组PRRSV毒株对Tregs诱导能力比较 | 第119页 |
| 3 讨论 | 第119-122页 |
| 参考文献 | 第122-128页 |
| 第五章 猪繁殖与呼吸综合征病毒中和抗体抗性毒株的筛选 | 第128-142页 |
| 1 材料与方法 | 第129-132页 |
| 1.1 材料 | 第129页 |
| 1.1.1 细胞和病毒 | 第129页 |
| 1.1.2 试剂 | 第129页 |
| 1.1.3 中和抗体血清 | 第129页 |
| 1.2 中和抗体抗性突变毒株的获得 | 第129-130页 |
| 1.3 抗性毒株基因测序 | 第130-131页 |
| 1.4 血清中和试验 | 第131页 |
| 1.5 病毒蚀斑检测 | 第131页 |
| 1.6 抗体于病毒结合能力分析 | 第131-132页 |
| 1.7 病毒生长曲线 | 第132页 |
| 1.8 数据分析 | 第132页 |
| 2 结果 | 第132-136页 |
| 2.1 NAb抗性毒株的获得 | 第132-133页 |
| 2.2 NAb抗性毒株序列分析 | 第133-135页 |
| 2.3 抗性毒株与抗体结合能力测定 | 第135-136页 |
| 3 讨论 | 第136-138页 |
| 参考文献 | 第138-142页 |
| 第六章 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M蛋白诱导中和抗体的关键氨基酸位点的确定 | 第142-164页 |
| 1 材料与方法 | 第143-149页 |
| 1.1 材料 | 第143-144页 |
| 1.1.1 细胞和病毒 | 第143页 |
| 1.1.2 试剂 | 第143页 |
| 1.1.3 中和抗体血清 | 第143-144页 |
| 1.2 血清中和试验 | 第144页 |
| 1.3 PRRSV感染性cDNA克隆的构建 | 第144-148页 |
| 1.3.1 BB和BB34s株全长cDNA克隆质粒的构建 | 第144-145页 |
| 1.3.2 BB和BB34s毒株相关点突变毒株cDNA全长克隆的构建 | 第145-148页 |
| 1.4 重组病毒的拯救 | 第148页 |
| 1.5 病毒蚀斑检测 | 第148页 |
| 1.6 抗体结合分析 | 第148页 |
| 1.7 病毒生长曲线 | 第148-149页 |
| 1.8 在PAMs进行的病毒单复制周期中和测定试验 | 第149页 |
| 1.9 数据分析 | 第149页 |
| 2 结果 | 第149-157页 |
| 2.1 重组PRRSV拯救 | 第149-150页 |
| 2.2 中和抗体结合位点的确定 | 第150-151页 |
| 2.3 抗性毒株与抗体结合能力分析 | 第151-152页 |
| 2.4 GP5蛋白Y102C和G104R突变抵抗NAb中和作用能力比较 | 第152-153页 |
| 2.5 不同NAb血清对抗性突变株的中和滴度测定 | 第153-154页 |
| 2.6 抗性毒株在PAMs上的中和滴度测定 | 第154-155页 |
| 2.7 抗性毒株与野生型毒株序列比对 | 第155-157页 |
| 3 讨论 | 第157-159页 |
| 参考文献 | 第159-164页 |
| 第七章 高致病性PRRSV对高原藏香猪的致病性研究 | 第164-184页 |
| 1 材料与方法 | 第165-169页 |
| 1.1 材料 | 第165页 |
| 1.1.1 细胞和病毒 | 第165页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第165页 |
| 1.1.3 试验动物 | 第165页 |
| 1.2 PAMs感染试验 | 第165-166页 |
| 1.3 猪体感染试验 | 第166页 |
| 1.4 病理学检查 | 第166-167页 |
| 1.4.1 病理组织切片制备 | 第166-167页 |
| 1.4.2 HE染色 | 第167页 |
| 1.5 免疫组化检测PRRSV | 第167-168页 |
| 1.6 荧光定量PCR检测PRRSV | 第168-169页 |
| 1.6.1 样品RNA提取 | 第168页 |
| 1.6.2 反转录 | 第168页 |
| 1.6.3 Real-time PCR | 第168-169页 |
| 1.7 PRRSV TCID_(50)测定 | 第169页 |
| 1.8 M-ELISA方法测定细胞因子 | 第169页 |
| 1.9 数据统计分析 | 第169页 |
| 2 结果 | 第169-178页 |
| 2.1 PAMs培养感染试验 | 第169-171页 |
| 2.2 猪体感染试验 | 第171-176页 |
| 2.2.1 临床症状观察 | 第171页 |
| 2.2.2 病理学观察 | 第171-173页 |
| 2.2.3 病毒血症测定结果 | 第173-174页 |
| 2.2.4 不同脏器组织中PRRSV测定 | 第174-176页 |
| 2.3 细胞因子水平的测定 | 第176-178页 |
| 3 讨论 | 第178-180页 |
| 参考文献 | 第180-184页 |
| 全文总结 | 第184-186页 |
| 本论文主要创新点 | 第186-188页 |
| 致谢 | 第188-190页 |
| 攻读博士学位期间发表论文 | 第190页 |
