| 中文摘要 | 第2-5页 |
| Abstract | 第5-8页 |
| 目录 | 第9-12页 |
| 前言 | 第12-15页 |
| 一、实验材料与仪器 | 第15-22页 |
| 1、实验材料 | 第15-17页 |
| 2、实验仪器 | 第17-18页 |
| 3、实验试剂的配制 | 第18-22页 |
| 二、实验方法 | 第22-40页 |
| 1. RACK1和PIAS2各重组质粒的构建 | 第22-29页 |
| 1.1 提取RNA | 第22页 |
| 1.2 逆转录合成第一链cDNA合成 | 第22-23页 |
| 1.3 设计引物序列如下 | 第23-24页 |
| 1.3.1 RACK1蛋白各截短片段引物设计如下 | 第23页 |
| 1.3.2 PIAS2蛋白各截短片段引物设计如下 | 第23-24页 |
| 1.3.3 PIAS-NY(DsRED)引物序列 | 第24页 |
| 1.4 PCR反应 | 第24页 |
| 1.5 割胶纯化 | 第24-25页 |
| 1.6 连接反应 | 第25页 |
| 1.7 转化 | 第25-26页 |
| 1.7.1 感受态的制备 | 第25-26页 |
| 1.7.2 转化 | 第26页 |
| 1.8 PCR鉴定 | 第26页 |
| 1.9 质粒DNA的提取 | 第26-27页 |
| 1.10 酶切鉴定 | 第27页 |
| 1.11 双酶切测序正确的质粒与表达载体 | 第27-28页 |
| 1.12 切胶回收 | 第28页 |
| 1.13 连接反应 | 第28页 |
| 1.14 转化 | 第28页 |
| 1.15 提取DNA | 第28-29页 |
| 1.16 酶切鉴定 | 第29页 |
| 2. 酵母双杂交实验 | 第29-30页 |
| 3. 细胞培养 | 第30-31页 |
| 3.1 细胞传代 | 第30页 |
| 3.2 细胞冻存 | 第30页 |
| 3.3 复苏冻存细胞 | 第30-31页 |
| 3.4 细胞瞬时转染 | 第31页 |
| 3.5 SDS裂解细胞方法 | 第31页 |
| 3.6 免疫共沉淀裂解细胞方法 | 第31页 |
| 4. 免疫共沉淀实验 | 第31-32页 |
| 5. Western Blot实验 | 第32-33页 |
| 6. 免疫荧光实验 | 第33-34页 |
| 7. 目的基因过表达慢病毒载体构建及慢病毒的包装 | 第34-40页 |
| 7.1 慢病毒载体线性化 | 第34页 |
| 7.2 引物合成 | 第34-35页 |
| 7.3 PCR扩增目的基因 | 第35页 |
| 7.4 酶切PCR产物 | 第35页 |
| 7.5 重组克隆制备 | 第35-37页 |
| 7.5.1 制备感受态细菌 | 第35-36页 |
| 7.5.2 目的基因片段连接入线性化载体 | 第36页 |
| 7.5.3 转化 | 第36-37页 |
| 7.6 阳性克隆的PCR鉴走 | 第37页 |
| 7.7 Lentivirus病毒包装 | 第37-38页 |
| 7.8 病毒的收获及浓缩 | 第38页 |
| 7.9 Lentivirus滴度测定 | 第38-39页 |
| 7.10 慢病毒侵染GC2细胞 | 第39页 |
| 7.11 抗生素筛选 | 第39-40页 |
| 三、实验结果 | 第40-59页 |
| 1. 酵母细胞中RACK1蛋白与PIAS2蛋白相互作用的确定 | 第40-41页 |
| 2. 哺乳动物中PIAS2蛋白与RACK1蛋白相互作用的验证 | 第41-44页 |
| 2.1 免疫共沉淀实验 | 第41页 |
| 2.2 RACK1蛋白与PIAS2蛋白在细胞共定位 | 第41-44页 |
| 2.2.1 应用细胞免疫荧光法进行两种蛋白的细胞共定位分析 | 第41-42页 |
| 2.2.2 应用荧光融合蛋白进行两种蛋白的细胞内共定位分析 | 第42-44页 |
| 3. RACK1蛋白与PIAS2蛋白相互作用关键区域的确定 | 第44-50页 |
| 3.1 RACK1与PIAS2相互作用关键区域的确定 | 第44-47页 |
| 3.1.1 RACK1蛋白各截短片段的构建 | 第44-46页 |
| 3.1.2 RACK1蛋白各截短片段与PIAS2蛋白相互作用分析 | 第46-47页 |
| 3.2 PIAS2蛋白与RACK1蛋白相互作用关键区域的确定 | 第47-50页 |
| 3.2.1 PIAS2蛋白各截短片段的构建 | 第47-49页 |
| 3.2.2 P1AS2蛋白各截短片段与RACK1(WD5-WD7)相互作用分析 | 第49-50页 |
| 4. RACK1蛋白与PIAS2蛋白相互作用的意义 | 第50-59页 |
| 4.1 PIAS2对RACK1的SUMO修饰作用 | 第50-52页 |
| 4.2 PIAS2蛋白过表达及其对RACK1蛋白表达的影响 | 第52-59页 |
| 4.2.1 PIAS2过表达慢病毒载体构建 | 第52-55页 |
| 4.2.2 慢病毒包装滴度测定 | 第55-57页 |
| 4.2.3 PIAS2稳定过表达细胞系的鉴定 | 第57页 |
| 4.2.4 过表达PIAS2对RACK1的影响 | 第57-59页 |
| 讨论 | 第59-63页 |
| 小结 | 第63-64页 |
| 参考文献 | 第64-67页 |
| 文献综述一 | 第67-73页 |
| 参考文献 | 第71-73页 |
| 文献综述二 | 第73-84页 |
| 参考文献 | 第79-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读学位期间完成论文 | 第85-86页 |
