| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略语表 | 第11-13页 |
| 1 文献综述 | 第13-27页 |
| 1.1 多基因共表达的研究背景 | 第13-22页 |
| 1.1.1 传统多基因共表达 | 第13页 |
| 1.1.2 翻译水平操纵的多蛋白共表达 | 第13-22页 |
| 1.2 HRV3C蛋白酶 | 第22-23页 |
| 1.3 新生肽链相关复合体(NAC)和触发因子(TF) | 第23-25页 |
| 1.3.1 新生肽链相关复合体(NAC) | 第23-24页 |
| 1.3.2 细菌的触发因子(TF) | 第24-25页 |
| 1.4 毕赤酵母表达系统 | 第25-26页 |
| 1.5 课题研究的目的 | 第26-27页 |
| 1.5.1 表达载体的选择 | 第26页 |
| 1.5.2 多基因共表达的优势 | 第26页 |
| 1.5.3 蛋白酶介导多基因共表达不同亚细胞靶向的实现 | 第26-27页 |
| 2 材料与方法 | 第27-39页 |
| 2.1 实验材料 | 第27-29页 |
| 2.1.1 菌株及质粒 | 第27页 |
| 2.1.2 酶和试剂 | 第27页 |
| 2.1.3 培养基及试剂 | 第27-29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-39页 |
| 2.2.1 质粒DNA提取 | 第29页 |
| 2.2.2 DNA片段回收 | 第29-30页 |
| 2.2.3 感受态细胞制备及转化 | 第30-31页 |
| 2.2.4 PCR扩增 | 第31页 |
| 2.2.5 SOE合成基因 | 第31-32页 |
| 2.2.6 酵母表达载体的构建 | 第32页 |
| 2.2.7 酵母表达载体的转化 | 第32-33页 |
| 2.2.8 多拷贝数插入转化子的筛选 | 第33页 |
| 2.2.9 重组酵母的PCR鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.10 诱导表达阳性转化子 | 第34页 |
| 2.2.11 表达产物沉淀样品制备 | 第34-35页 |
| 2.2.12 表达产物上清(His)_6蛋白的Ni~(2+)亲和纯化 | 第35页 |
| 2.2.13 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第35-36页 |
| 2.2.14 目的蛋白western blot检测 | 第36页 |
| 2.2.15 引物 | 第36-39页 |
| 3 结果与分析 | 第39-54页 |
| 3.1 目的基因克隆 | 第39-42页 |
| 3.1.1 SOE法合成基因th,nh和kar | 第39-41页 |
| 3.1.2 PCR合成基因aox,αF,3c和gfp | 第41-42页 |
| 3.2 酵母表达载体的构建 | 第42-45页 |
| 3.2.1 pPIC3.5K表达载体的获得 | 第42页 |
| 3.2.2 多蛋白共表达载体的获得 | 第42-44页 |
| 3.2.3 酶切检测多蛋白共表达载体 | 第44-45页 |
| 3.3 酵母转化,鉴定及多拷贝筛选 | 第45-49页 |
| 3.3.1 多蛋白共表达载体的线性化 | 第45-46页 |
| 3.3.2 多蛋白共表达载体的酵母转化 | 第46-47页 |
| 3.3.3 多拷贝转化子的筛选 | 第47-48页 |
| 3.3.4 PCR快速鉴定阳性克隆 | 第48-49页 |
| 3.4 酵母诱导表达及蛋白检测 | 第49-54页 |
| 3.4.1 酵母诱导表达条件测试 | 第49-50页 |
| 3.4.2 酵母诱导GFP细胞质表达 | 第50-51页 |
| 3.4.3 酵母诱导GFP细胞外表达 | 第51-52页 |
| 3.4.4 酵母诱导GFP内质网表达 | 第52-54页 |
| 4 讨论 | 第54-62页 |
| 4.1 3C蛋白酶对细胞的可能影响分析 | 第54页 |
| 4.2 3C蛋白酶核糖体定位原理 | 第54-56页 |
| 4.3 NAC的核糖体结合域HLH结构 | 第56页 |
| 4.4 分子伴侣NAC在不同生物界的保守性 | 第56-57页 |
| 4.5 多蛋白系统与进入内质网过程分析 | 第57-58页 |
| 4.6 酵母两种靶向内质网的途径 | 第58-59页 |
| 4.7 核糖体功能改造 | 第59-60页 |
| 4.8 酵母表达蛋白的糖基化 | 第60-61页 |
| 4.9 小结 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-70页 |
| 致谢 | 第70页 |
