| 摘要 | 第7-8页 |
| ABSTRACT | 第8-9页 |
| 符号与缩略语说明 | 第10-11页 |
| 前言 | 第11-12页 |
| 第一章 文献综述 | 第12-26页 |
| 1. 抗生素的应用及危害 | 第12页 |
| 2. 大肠杆菌细胞壁介绍 | 第12-13页 |
| 3. D-丙氨酸与丙氨酸消旋酶 | 第13-15页 |
| 4. 基因打靶技术 | 第15-18页 |
| 5. 克隆载体及应用 | 第18-20页 |
| 参考文献 | 第20-26页 |
| 第二章 大肠杆菌D-丙氨酸消旋酶双基因缺失突变株的构建及生长特性研究 | 第26-52页 |
| 1. 材料 | 第26-28页 |
| 1.1 主要仪器 | 第26页 |
| 1.2 培养基与试剂 | 第26-28页 |
| 1.3 抗生素及使用浓度 | 第28页 |
| 2 实验方法 | 第28-39页 |
| 2.1 质粒DNA的小量提取 | 第28-29页 |
| 2.2 普通感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第29页 |
| 2.3 酶连产物的转化 | 第29页 |
| 2.4 打靶元件的制备与处理 | 第29-35页 |
| 2.4.1 线性双链DNA打靶元件的扩增 | 第30-31页 |
| 2.4.2 PCR产物纯化 | 第31-32页 |
| 2.4.3 PCR产物加“A”尾 | 第32页 |
| 2.4.4 酶连 | 第32页 |
| 2.4.5 酶连产物的转化 | 第32-33页 |
| 2.4.6 质粒DNA的小量提取 | 第33页 |
| 2.4.7 测序验证 | 第33页 |
| 2.4.8 电转化打靶元件的预处理 | 第33-35页 |
| 2.5 重组酶基因的诱导表达和电转化感受态细胞的制备 | 第35-36页 |
| 2.6 打靶载体的电击转化 | 第36页 |
| 2.7 阳性克隆子的获得与验证 | 第36-38页 |
| 2.7.1 质粒pKD46的消除及验证 | 第37页 |
| 2.7.2 氯霉素抗性基因的消除及验证 | 第37-38页 |
| 2.7.3 突变株D-丙氨酸依赖性验证 | 第38页 |
| 2.8 基因dadX的敲除 | 第38页 |
| 2.8.1 质粒pKD46的消除及验证 | 第38页 |
| 2.8.2 氯霉素抗性基因的消除及验证 | 第38页 |
| 2.8.3 alr、dadX双基因缺失突变株对D-丙氨酸的依赖性验证 | 第38页 |
| 2.9 D-丙氨酸依赖浓度测定 | 第38-39页 |
| 2.10 生长曲线测定、菌落计数及镜检 | 第39页 |
| 3 结果 | 第39-47页 |
| 3.1 电转化打靶元件 | 第39-40页 |
| 3.2 阳性转化子同源重组的PCR验证 | 第40页 |
| 3.3 质粒pKD46的消除及验证 | 第40-41页 |
| 3.4 氯霉素抗性基因的消除及验证 | 第41-42页 |
| 3.5 alr单基因缺失突变株对D-丙氨酸的依赖性验证及保存 | 第42页 |
| 3.6 alr、dadX双基因缺失突变株的获得及验证 | 第42-44页 |
| 3.7 alr、dadX双基因缺失突变株对D-丙氨酸的依赖性验证及保存 | 第44-45页 |
| 3.8 敲除后菌株对D-丙氨酸依赖浓度测定 | 第45-46页 |
| 3.9 生长曲线测定、菌落计数及镜检 | 第46-47页 |
| 4 讨论 | 第47-49页 |
| 本章小结 | 第49-50页 |
| 参考文献 | 第50-52页 |
| 第三章 克隆载体pECO21的构建及应用 | 第52-74页 |
| 1 材料 | 第52-54页 |
| 1.1 主要仪器 | 第52页 |
| 1.2 培养基与试剂 | 第52-53页 |
| 1.3 抗生素及使用浓度 | 第53-54页 |
| 2 实验方法 | 第54-62页 |
| 2.1 质粒DNA的小量提取及普通感受态细胞的制备(CaCl_2法) | 第54页 |
| 2.2 酶连产物的转化 | 第54页 |
| 2.3 重叠延伸PCR技术 | 第54-55页 |
| 2.4 基因回补菌株pMD19-alr的构建 | 第55-56页 |
| 2.4.1 alr基因的体外扩增 | 第55-56页 |
| 2.4.2 PCR产物纯化及酶连、转化 | 第56页 |
| 2.4.3 质粒提取及测序验证 | 第56页 |
| 2.5 含有突变位点的丙氨酸消旋酶基因alr的PCR扩增、纯化及TA克隆 | 第56-59页 |
| 2.5.1. 扩增含有突变位点的基因片段 | 第57-58页 |
| 2.5.2 扩增含有突变位点的全长基因片段 | 第58页 |
| 2.5.3 PCR产物的纯化,加“A”尾及酶连、转化 | 第58页 |
| 2.5.4 提取质粒并进行酶切验证 | 第58-59页 |
| 2.6 pUC18部分序列扩增、纯化及TA克隆 | 第59-60页 |
| 2.7 克隆载体pECO21的构建及应用 | 第60-62页 |
| 2.7.1 含突变位点基因片段及部分pUC18载体片段的XhoI单酶切及纯化 | 第61-62页 |
| 2.7.2 含突变位点的目的基因与部分pUC18载体片段的酶连 | 第62页 |
| 2.7.3 酶连产物的转化和克隆菌株的构建 | 第62页 |
| 3 结果与分析 | 第62-67页 |
| 3.1 突变株回补验证 | 第62-63页 |
| 3.2 克隆载体pECO21的构建 | 第63-67页 |
| 3.2.1 含突变位点基因片段的扩增 | 第63-64页 |
| 3.2.2 含突变位点基因片段克隆子的质粒提取、酶切及核酸测序验证 | 第64-65页 |
| 3.2.3 部分pUC18载体片段的扩增 | 第65页 |
| 3.2.4 克隆载体pECO21的质粒提取及酶切验证 | 第65-66页 |
| 3.2.6 应用及展望 | 第66-67页 |
| 4 讨论 | 第67-70页 |
| 本章小结 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-74页 |
| 全文总结及展望 | 第74-76页 |
| 本文创新之处 | 第76-78页 |
| 附录 | 第78-82页 |
| 附录一：文中所用培养基和试剂配方 | 第78-79页 |
| 附录二：文中所用主要仪器 | 第79-80页 |
| 附录三：alr序列 | 第80-81页 |
| 附录四：dadX序列 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82页 |
