| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-9页 |
| 文献综述 | 第14-36页 |
| 第一章 转基因技术在家畜中应用的研究进展 | 第14-19页 |
| 1.1 应用于家畜生产的转基因技术概况 | 第14-17页 |
| 1.1.1 慢病毒介导的转基因技术 | 第14页 |
| 1.1.2 条件型转基因技术 | 第14-15页 |
| 1.1.3 RNAi介导的转基因技术 | 第15页 |
| 1.1.4 转座子转基因技术 | 第15-16页 |
| 1.1.5 人工核酸酶技术 | 第16-17页 |
| 1.2 转基因技术在家畜繁殖育种方面的应用 | 第17-19页 |
| 1.2.1 在提高家畜乳制品质量方面的应用 | 第17页 |
| 1.2.2 在家畜生长和胴体成分组成改善方面的应用 | 第17-18页 |
| 1.2.3 在家畜抗病方面的应用 | 第18页 |
| 1.2.4 在家畜繁殖性能和生产力提高方面的应用 | 第18页 |
| 1.2.5 在生产环境友好型家畜方面的应用 | 第18-19页 |
| 第二章 基因打靶技术研究进展 | 第19-36页 |
| 2.1 基因打靶技术的发展 | 第19-20页 |
| 2.2 人工核酸酶技术 | 第20-30页 |
| 2.2.1 锌指核酸酶 | 第20-23页 |
| 2.2.2 类转录激活因子效应物核酸酶 | 第23-26页 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9 | 第26-28页 |
| 2.2.4 人工核酸酶的优化策略 | 第28-29页 |
| 2.2.5 ZFN、TALEN与RGEN的优缺点比较 | 第29-30页 |
| 2.3 基因打靶技术的基本策略 | 第30-32页 |
| 2.3.1 基因敲除 | 第31页 |
| 2.3.2 基因敲入 | 第31-32页 |
| 2.3.3 基因修正和点突变 | 第32页 |
| 2.3.4 染色体重排 | 第32页 |
| 2.4 基因打靶技术的应用 | 第32-35页 |
| 2.4.1 在胚胎干细胞中的应用 | 第32-33页 |
| 2.4.2 在生产疾病模型中的应用 | 第33页 |
| 2.4.3 在抗病育种转基因动物生产方面的应用 | 第33页 |
| 2.4.4 在研究基因功能和细胞治疗方面的应用 | 第33-34页 |
| 2.4.5 在制备生物反应器方面的应用 | 第34页 |
| 2.4.6 在人类健康方面的应用 | 第34-35页 |
| 2.5 选题背景与目的意义 | 第35-36页 |
| 试验研究 | 第36-100页 |
| 第三章 靶向山羊BLG基因的ZFNS、TALENS及基因打靶载体的制备与功能分析 | 第36-61页 |
| 3.1 材料与试剂 | 第37-38页 |
| 3.1.1 材料 | 第37页 |
| 3.1.2 质粒 | 第37页 |
| 3.1.3 试剂 | 第37-38页 |
| 3.1.4 引物合成及测序 | 第38页 |
| 3.2 方法 | 第38-47页 |
| 3.2.1 奶山羊BLG位点的ZFNs表达质粒的制备与鉴定 | 第38页 |
| 3.2.2 奶山羊BLG位点的TALENs表达质粒的制备与鉴定 | 第38-39页 |
| 3.2.3 奶山羊BLG位点G418抗性基因打靶载体pG的构建 | 第39-43页 |
| 3.2.4 奶山羊BLG位点puro抗性基因打靶载体pHSQ的构建 | 第43-44页 |
| 3.2.5 奶山羊BLG位点基因打靶载体各元件的生物活性鉴定 | 第44页 |
| 3.2.6 ZFN与TALEN介导基因打靶载体在山羊BLG位点的同源重组活性鉴定 | 第44-45页 |
| 3.2.7 奶山羊BLG位点基因打靶载体在奶山羊乳腺上皮细胞中的功能鉴定 | 第45-47页 |
| 3.3 结果 | 第47-58页 |
| 3.3.1 奶山羊BLG位点的ZFNs表达质粒的制备及酶切鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3.2 奶山羊BLG位点的TALENs表达质粒的制备及酶切鉴定 | 第48-49页 |
| 3.3.3 酵母MEL1报告分析ZFNs表达质粒的切割活性 | 第49-50页 |
| 3.3.4 奶山羊BLG位点基因打靶载体pG的构建与鉴定 | 第50-53页 |
| 3.3.5 奶山羊BLG位点基因打靶载体pHSQ的构建与鉴定 | 第53-55页 |
| 3.3.6 ZFN与TALEN介导基因打靶载体在山羊BLG位点的同源重组活性鉴定 | 第55-56页 |
| 3.3.7 基因打靶载体在奶山羊乳腺上皮细胞的功能鉴定 | 第56-58页 |
| 3.4 讨论 | 第58-60页 |
| 3.5 小结 | 第60-61页 |
| 第四章 ZFN与TALEN介导HLF定向整合至奶山羊BLG位点的效率评估 | 第61-78页 |
| 4.1 材料与试剂 | 第62页 |
| 4.1.1 材料 | 第62页 |
| 4.1.2 试剂 | 第62页 |
| 4.1.3 引物合成及测序 | 第62页 |
| 4.2 方法 | 第62-67页 |
| 4.2.1 原代奶山羊胎儿成纤维细胞的培养与性别鉴定 | 第62-63页 |
| 4.2.2 TALEN与ZFN介导hLF定向整合至BLG位点阳性细胞的筛选 | 第63-64页 |
| 4.2.3 TALEN与ZFN介导hLF定向整合至BLG位点阳性细胞的鉴定 | 第64-67页 |
| 4.3 结果 | 第67-75页 |
| 4.3.1 奶山羊胎儿成纤维细胞的培养结果 | 第67-68页 |
| 4.3.2 ZFN介导hLF整合至BLG位点的阳性克隆筛选与鉴定 | 第68-71页 |
| 4.3.3 TALEN介导hLF整合至BLG位点的阳性克隆筛选与鉴定 | 第71-74页 |
| 4.3.4 ZFN与TALEN介导hLF整合至BLG位点的效率评估 | 第74-75页 |
| 4.4 讨论 | 第75-76页 |
| 4.5 小结 | 第76-78页 |
| 第五章 应用体细胞核移植技术生产基因打靶奶山羊 | 第78-89页 |
| 5.1 材料与试剂 | 第78-79页 |
| 5.1.1 材料 | 第78-79页 |
| 5.1.2 试剂 | 第79页 |
| 5.1.3 测试化验加工 | 第79页 |
| 5.2 方法 | 第79-82页 |
| 5.2.1 体细胞核移植、胚胎移植 | 第79-80页 |
| 5.2.2 基因打靶克隆奶山羊的鉴定 | 第80-82页 |
| 5.3 结果 | 第82-86页 |
| 5.3.1 基因打靶细胞的体细胞核移植与克隆胚胎的发育 | 第82-84页 |
| 5.3.2 基因打靶克隆奶山羊的PCR和测序鉴定 | 第84-86页 |
| 5.3.3 基因打靶克隆奶山羊的southern blot鉴定 | 第86页 |
| 5.4 讨论 | 第86-88页 |
| 5.5 小结 | 第88-89页 |
| 第六章 基因打靶克隆奶山羊的检测 | 第89-100页 |
| 6.1 试剂 | 第90页 |
| 6.2 方法 | 第90-94页 |
| 6.2.1 基因打靶克隆奶山羊的发情鉴定及配种 | 第90页 |
| 6.2.2 基因打靶克隆奶山羊的后代生产与鉴定 | 第90页 |
| 6.2.3 基因打靶克隆奶山羊的乳汁组分鉴定 | 第90-91页 |
| 6.2.4 基因打靶克隆奶山羊乳汁中BLG表达检测 | 第91-93页 |
| 6.2.5 基因打靶克隆奶山羊乳汁中外源基因hLF的表达检测 | 第93-94页 |
| 6.3 结果 | 第94-98页 |
| 6.3.1 基因打靶克隆奶山羊繁殖性能评估结果 | 第94页 |
| 6.3.2 基因打靶克隆奶山羊的后代生产与鉴定结果 | 第94-95页 |
| 6.3.3 基因打靶奶山羊的乳汁成分分析结果 | 第95-96页 |
| 6.3.4 基因打靶克隆奶山羊乳汁中BLG表达检测 | 第96-97页 |
| 6.3.5 基因打靶奶山羊乳汁的hLF表达检测 | 第97-98页 |
| 6.4 讨论 | 第98-99页 |
| 6.5 小结 | 第99-100页 |
| 结论 | 第100-101页 |
| 创新之处和进一步研究的课题 | 第101-102页 |
| 参考文献 | 第102-121页 |
| 附录 | 第121-125页 |
| 致谢 | 第125-126页 |
| 作者简介 | 第126页 |
