| 摘要 | 第5-7页 |
| Abstract | 第7-8页 |
| 目录 | 第9-13页 |
| 第一部分 应用SrtA特异性标记法研究G蛋白偶联受体G2A时空动态变化 | 第13-87页 |
| 第1章 前言 | 第13-31页 |
| 1.1 序 | 第13页 |
| 1.2 G蛋白偶联受体概述 | 第13-18页 |
| 1.2.1 G蛋白偶联受体的功能和结构 | 第13-15页 |
| 1.2.2 G蛋白偶联受体迁移的研究进展 | 第15-17页 |
| 1.2.3 质子敏感性G2A受体 | 第17-18页 |
| 1.3 蛋白质标记技术 | 第18-29页 |
| 1.3.1 荧光蛋白标记技术 | 第18-19页 |
| 1.3.2 基于肽-小分子探针间非共价结合的标记技术 | 第19-22页 |
| 1.3.3 基于酶促反应共价结合的标记技术 | 第22-25页 |
| 1.3.4 基于转肽酶Sortase A的标记技术 | 第25-29页 |
| 1.4 本研究的研究目的和研究内容 | 第29-31页 |
| 1.4.1 研究目的 | 第29页 |
| 1.4.2 研究内容 | 第29-31页 |
| 第2章 细胞外N端标记G蛋白偶联受体G2A | 第31-55页 |
| 2.1 引言 | 第31-33页 |
| 2.2 实验 | 第33-38页 |
| 2.2.1 重组His6-SrtA的制备 | 第33-34页 |
| 2.2.2 LPETGG多肽及标记分子Alexa Fluor 488-LPETGG的合成 | 第34-35页 |
| 2.2.3 溶液配制 | 第35-36页 |
| 2.2.4 LPETG5(Sor)-HA-G2A转染HEK293T细胞 | 第36-37页 |
| 2.2.5 LPETG5(Sor)-HA-G2A在HEK293T细胞中的表达 | 第37-38页 |
| 2.2.6 基于SrtA调控的G2A切断、标记反应 | 第38页 |
| 2.3 结果与讨论 | 第38-54页 |
| 2.3.1 His_6-SrtA纯化和活性检测 | 第38-41页 |
| 2.3.2 多肽和荧光分子修饰多肽的HPLC纯化及表征 | 第41-46页 |
| 2.3.3 LPETG5(Sor)-HA-G2A在HEK293T细胞中的表达 | 第46-49页 |
| 2.3.4 SrtA调控的G2A可视化荧光标记 | 第49-54页 |
| 2.4 本章小结 | 第54-55页 |
| 第3章 G2A在HEK293T细胞中的pH依赖性时空分布 | 第55-87页 |
| 3.1 引言 | 第55-57页 |
| 3.2 实验 | 第57-62页 |
| 3.2.1 溶液配制 | 第57页 |
| 3.2.2 G2A突变体H174F和R203A质粒构建 | 第57-60页 |
| 3.2.3 LPC对G2A标记反应和胞内时空分布的影响 | 第60-61页 |
| 3.2.4 荧光标记G2A及突变体在细胞内迁移随pH变化的时间依赖 | 第61页 |
| 3.2.5 荧光标记受体定位共染色 | 第61页 |
| 3.2.6 图像分析和数据处理 | 第61-62页 |
| 3.3 结果与讨论 | 第62-84页 |
| 3.3.1 突变体H174F和R203A质粒构建 | 第62-64页 |
| 3.3.2 LPC对G2A在细胞膜上表达和分布的影响 | 第64-69页 |
| 3.3.3 G2A受体在HEK293T细胞中分布与迁移对pH及LPC的应答性 | 第69-75页 |
| 3.3.4 G2A突变体R203A在HEK293T细胞中对LPC的应答性 | 第75-78页 |
| 3.3.5 G2A突变体H174F在HEK293T细胞中对pH的敏感性 | 第78-79页 |
| 3.3.6 G2A胞内积累亚细胞染色定位 | 第79-82页 |
| 3.3.7 胞外pH诱导的G2A循环迁移 | 第82-84页 |
| 3.4 本章小结 | 第84-87页 |
| 第二部分 锰离子转运膜蛋白MntH转运活性、跨膜螺旋结构研究 | 第87-135页 |
| 第4章 前言 | 第87-103页 |
| 4.1 序 | 第87-88页 |
| 4.2 金属离子转运蛋白 | 第88-90页 |
| 4.2.1 金属离子的平衡 | 第88-89页 |
| 4.2.2 金属离子转运蛋白研究进展 | 第89-90页 |
| 4.3 Nramp转运蛋白家族 | 第90-94页 |
| 4.3.1 Nramp的发现和分类 | 第90-91页 |
| 4.3.2 Nramp家族的生理作用 | 第91-94页 |
| 4.4 MntH概述 | 第94-97页 |
| 4.4.1 MntH | 第94页 |
| 4.4.2 MntH的结构和功能研究进展 | 第94-97页 |
| 4.5 膜蛋白结构研究方法 | 第97-100页 |
| 4.5.1 圆二色谱法 | 第97-99页 |
| 4.5.2 二维核磁共振技术 | 第99页 |
| 4.5.3 其它方法 | 第99-100页 |
| 4.6 本章的研究目的和内容 | 第100-103页 |
| 4.6.1 研究目的 | 第100页 |
| 4.6.2 研究内容 | 第100-103页 |
| 第5章 荧光探针检测MntH转运Mn~(2+)的活性 | 第103-115页 |
| 5.1 引言 | 第103-104页 |
| 5.2 实验 | 第104-106页 |
| 5.2.1 溶液配制 | 第104页 |
| 5.2.2 菌株培养和收集 | 第104页 |
| 5.2.3 荧光探针pH依赖曲线 | 第104-105页 |
| 5.2.4 SDS-PAGE和Western Blot | 第105页 |
| 5.2.5 MntH的Mn~(2+)转运活性测定 | 第105页 |
| 5.2.6 WT-MntH和突变体转运Mn~(2+)活性比较 | 第105-106页 |
| 5.3 结果与讨论 | 第106-114页 |
| 5.3.1 MntH的原核表达 | 第106-107页 |
| 5.3.2 MntH转运Mn~(2+)活性测定 | 第107-111页 |
| 5.3.3 WT-MntH和酸性氨基酸突变体转运活性 | 第111-114页 |
| 5.4 本章小节 | 第114-115页 |
| 第6章 与MntH功能相关跨膜螺旋(MntH-TM3)的结构表征 | 第115-133页 |
| 6.1 引言 | 第115-117页 |
| 6.2 实验 | 第117-118页 |
| 6.2.1 样品制备 | 第117页 |
| 6.2.2 圆二色谱测定 | 第117-118页 |
| 6.2.3 HSQC谱测定 | 第118页 |
| 6.3 结果与讨论 | 第118-132页 |
| 6.3.1 多肽MntH-TM3在不同浓度三氟乙醇(TFE)中的二级结构 | 第118-120页 |
| 6.3.2 多肽MntH-TM3在不同浓度SDS中的二级结构 | 第120-121页 |
| 6.3.3 多肽MntH-TM3在脂质体中的二级结构 | 第121-126页 |
| 6.3.4 pH对多肽MntH-TM3二级结构的影响 | 第126-127页 |
| 6.3.5 锰离子浓度对多肽MntH-TM3的结构影响 | 第127-130页 |
| 6.3.6 MntH-TM3的HSQC异核单量子相关谱 | 第130-132页 |
| 6.4 本章小结 | 第132-133页 |
| 第7章 全文总结与创新点 | 第133-135页 |
| 7.1 全文总结 | 第133-134页 |
| 7.2 创新点 | 第134-135页 |
| 参考文献 | 第135-159页 |
| 附录一 | 第159-163页 |
| 附录二 | 第163-165页 |
| 攻读博士期间发表的论文 | 第165-166页 |
| 致谢 | 第166页 |
