| 摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 第一部分：序言 | 第14-27页 |
| 1.1 芋螺毒素研究进展 | 第14-26页 |
| 1.1.1 芋螺毒素的分类和命名 | 第14-16页 |
| 1.1.2 芋螺毒素基因的获取方法 | 第16-18页 |
| 1.1.3 芋螺毒素多样性 | 第18-19页 |
| 1.1.4 芋螺毒素获取途径 | 第19-22页 |
| 1.1.5 芋螺毒素的药理学活性 | 第22-24页 |
| 1.1.6 芋螺毒素的药用价值 | 第24-26页 |
| 1.2 研究目的与意义 | 第26-27页 |
| 第二部分 芋螺毒素基因GeXIVAWT在大肠杆菌中表达 | 第27-54页 |
| 2.1 材料 | 第28-30页 |
| 2.1.1 菌株、质粒和基因 | 第28页 |
| 2.1.2 工具酶及试剂 | 第28页 |
| 2.1.3 培养基与抗生素 | 第28页 |
| 2.1.4 试剂和缓冲液 | 第28-29页 |
| 2.1.5 仪器设备 | 第29-30页 |
| 2.2 方法 | 第30-38页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第30页 |
| 2.2.2 退火反应 | 第30页 |
| 2.2.3 大肠杆菌质粒DNA的制备 | 第30-31页 |
| 2.2.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第31页 |
| 2.2.5 表达载体质粒双酶切 | 第31-32页 |
| 2.2.6 琼脂糖电泳回收DNA | 第32页 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞制备 | 第32页 |
| 2.2.8 大肠杆菌感受态菌转化效率检测 | 第32-33页 |
| 2.2.9 连接转化 | 第33-34页 |
| 2.2.10 PCR筛选转化子 | 第34页 |
| 2.2.11 表达载体重组子测序 | 第34页 |
| 2.2.12 重组蛋白的诱导表达 | 第34-35页 |
| 2.2.13 Tricine-SDS-PAGE分析表达产物 | 第35页 |
| 2.2.14 重组菌株培养条件优化方法 | 第35-36页 |
| 2.2.15 蛋白质的亲和层析 | 第36页 |
| 2.2.16 HPLC纯化目的蛋白 | 第36页 |
| 2.2.17 MALDI-TOF质谱鉴定 | 第36-37页 |
| 2.2.18 目的蛋白的体外折叠 | 第37页 |
| 2.2.19 细胞培养 | 第37页 |
| 2.2.20 活性检测 | 第37-38页 |
| 2.3 结果与分析 | 第38-51页 |
| 2.3.1 引物设计 | 第38-39页 |
| 2.3.2 载体构建示意图 | 第39页 |
| 2.3.3 表达载体构建 | 第39-41页 |
| 2.3.4 目的蛋白的诱导表达 | 第41-43页 |
| 2.3.5 重组蛋白表达条件优化 | 第43-45页 |
| 2.3.6 重组蛋白初步分离纯化 | 第45-47页 |
| 2.3.7 重组芋螺毒素的复性条件优化 | 第47-48页 |
| 2.3.8 重组芋螺毒素的RP-HPLC分析和质谱鉴定 | 第48-51页 |
| 2.3.9 活性实验 | 第51页 |
| 2.4 讨论 | 第51-54页 |
| 第三部分 芋螺毒素基因MrVIB在大肠杆菌中表达 | 第54-66页 |
| 3.1 材料 | 第55页 |
| 3.1.1 菌株、质粒和基因 | 第55页 |
| 3.1.2 实验动物 | 第55页 |
| 3.1.3 基本试剂 | 第55页 |
| 3.1.4 仪器设备 | 第55页 |
| 3.2 方法 | 第55-57页 |
| 3.2.1 引物设计 | 第55-56页 |
| 3.2.2 基本实验操作 | 第56页 |
| 3.2.3 热板实验 | 第56页 |
| 3.2.4 福尔马林实验 | 第56页 |
| 3.2.5 CCI实验模型 | 第56-57页 |
| 3.3 结果与分析 | 第57-63页 |
| 3.3.1 载体构建示意图 | 第57页 |
| 3.2.2 表达载体构建 | 第57-58页 |
| 3.3.3 重组蛋白的诱导表达 | 第58-59页 |
| 3.3.4 重组蛋白分离纯化和鉴定 | 第59-61页 |
| 3.3.5 重组芋螺毒素MrVIB的活性 | 第61-63页 |
| 3.4 讨论 | 第63-66页 |
| 第四部分 芋螺毒素基因MrVIB在毕赤酵母中表达 | 第66-82页 |
| 4.1 材料 | 第67-68页 |
| 4.1.1 菌株和质粒 | 第67页 |
| 4.1.2 工具酶及试剂 | 第67页 |
| 4.1.3 培养基与抗生素 | 第67-68页 |
| 4.1.4 仪器设备 | 第68页 |
| 4.2 方法 | 第68-73页 |
| 4.2.1 引物设计 | 第68-69页 |
| 4.2.2 表达载体的构建 | 第69-72页 |
| 4.2.3 酵母重组子的诱导表达 | 第72-73页 |
| 4.3 结果与分析 | 第73-80页 |
| 4.3.1 引物设计 | 第73-74页 |
| 4.3.2 毕赤酵母表达载体构建 | 第74-76页 |
| 4.3.3 酵母菌电转化及阳性转化子鉴定 | 第76-78页 |
| 4.3.4 毕赤酵母重组子诱导表达 | 第78-80页 |
| 4.4 讨论 | 第80-82页 |
| 第五部分 芋螺毒素基因MrVIB在昆虫细胞中表达 | 第82-94页 |
| 5.1 材料 | 第83页 |
| 5.1.1 菌株与质粒 | 第83页 |
| 5.1.2 细胞与培养基 | 第83页 |
| 5.1.3 工具酶及试剂 | 第83页 |
| 5.1.4 仪器设备 | 第83页 |
| 5.2 方法 | 第83-87页 |
| 5.2.1 引物合成 | 第83-84页 |
| 5.2.2 转移载体构建 | 第84-85页 |
| 5.2.3 重组Bacmid载体的构建 | 第85页 |
| 5.2.4 重组杆状病毒的制备和鉴定 | 第85-87页 |
| 5.3 结果与分析 | 第87-92页 |
| 5.3.1 基因在昆虫细胞中的表达过程 | 第87页 |
| 5.3.2 转移载体构建 | 第87-88页 |
| 5.3.3 重组Bacmid载体构建 | 第88-90页 |
| 5.3.4 昆虫细胞培养及活力检测 | 第90-91页 |
| 5.3.5 重组病毒感染昆虫细胞 | 第91页 |
| 5.3.6 重组蛋白的表达检测 | 第91-92页 |
| 5.4 讨论 | 第92-94页 |
| 第六部分 芋螺毒素基因MrVIB在CHO细胞中表达 | 第94-106页 |
| 6.1 材料 | 第95页 |
| 6.1.1 菌株与质粒 | 第95页 |
| 6.1.2 细胞与培养基 | 第95页 |
| 6.1.3 工具酶及试剂 | 第95页 |
| 6.1.4 仪器设备 | 第95页 |
| 6.2 方法 | 第95-99页 |
| 6.2.1 引物设计 | 第95-96页 |
| 6.2.2 表达载体的构建 | 第96-97页 |
| 6.2.3 重组表达载体在CHO细胞中表达 | 第97-99页 |
| 6.3 结果与分析 | 第99-104页 |
| 6.3.1 重组载体构建 | 第99-101页 |
| 6.3.2 基因在CHO细胞中的表达过程 | 第101-102页 |
| 6.3.3 CHO细胞培养 | 第102页 |
| 6.3.4 G418浓度的确定 | 第102页 |
| 6.3.5 细胞的筛选结果 | 第102-103页 |
| 6.3.6 电泳分析重组蛋白表达 | 第103-104页 |
| 6.4 讨论 | 第104-106页 |
| 第七部分 结论 | 第106-108页 |
| 7.1 芋螺毒素基因GeXIVAWT在大肠杆菌中的表达 | 第106页 |
| 7.2 芋螺毒素基因MrVIB在大肠杆菌中的表达 | 第106页 |
| 7.3 芋螺毒素基因MrVIB在毕赤酵母中的表达 | 第106页 |
| 7.4 芋螺毒素基因MrVIB在昆虫细胞中的表达 | 第106页 |
| 7.5 芋螺毒素基因MrVIB在哺乳动物细胞中的表达 | 第106-107页 |
| 7.6 芋螺毒素基因在四种表达系统中的表达比较 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-115页 |
| 致谢 | 第115-116页 |
| 在读期间发表论文 | 第116-117页 |
