| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一部分 前言 | 第14-25页 |
| 1.1 细胞自噬概念 | 第14-16页 |
| 1.1.1 细胞自噬的分类和特征 | 第14-16页 |
| 1.2 细胞自噬的发生过程及其分子机制 | 第16-22页 |
| 1.2.1 自噬的诱导及其调控 | 第16-18页 |
| 1.2.2 自噬溶酶体形成及其调控 | 第18-21页 |
| 1.2.3 自噬体的降解及重复利用 | 第21-22页 |
| 1.3 自噬相关基因 | 第22-24页 |
| 1.3.1 ATG1的功能 | 第22-23页 |
| 1.3.2 其他自噬相关基因 | 第23-24页 |
| 1.4 本课题研究目的与意义 | 第24-25页 |
| 第二部分 实验材料 | 第25-33页 |
| 2.1 细胞系和细胞培养基 | 第25页 |
| 2.2 质粒和菌株 | 第25页 |
| 2.3 实验动物 | 第25页 |
| 2.3.1 斜纹夜蛾 | 第25页 |
| 2.3.2 小鼠 | 第25页 |
| 2.3.3 兔子 | 第25页 |
| 2.4 主要实验药品与试剂 | 第25-26页 |
| 2.5 常用溶液及其配制 | 第26-30页 |
| 2.5.1 PBS(磷酸盐缓冲液) | 第26-27页 |
| 2.5.2 PUCKS'液 | 第27页 |
| 2.5.3 昆虫生理盐水IBSS | 第27页 |
| 2.5.4 1O×TBE | 第27页 |
| 2.5.5 卡那霉素(Kanamycin)与氨苄青霉素(Ampicillin) | 第27页 |
| 2.5.6 碱裂解法提取质粒DNA所用溶液 | 第27页 |
| 2.5.7 SDS-PAGE凝胶电泳所用溶液 | 第27-28页 |
| 2.5.8 蛋白免疫印迹(Western Blot)相关的溶液 | 第28-29页 |
| 2.5.9 SDS-PAGE凝胶及Tricine-PAGE 凝胶的配制 | 第29页 |
| 2.5.10 转染用无血清Grace's | 第29-30页 |
| 2.6 常用培养基的配制 | 第30-31页 |
| 2.6.1 昆虫Grace's Insect Cell Culture Medium(1L) | 第30页 |
| 2.6.2 液体LB培养基 | 第30-31页 |
| 2.6.3 固体LB培养基 | 第31页 |
| 2.6.4 斜纹夜蛾幼虫人工饲料的配制 | 第31页 |
| 2.7 主要实验仪器与型号 | 第31-33页 |
| 第三部分 实验方法 | 第33-46页 |
| 3.1 细胞总RNA的提取 | 第33页 |
| 3.2 SlAtg1保守区的扩增 | 第33-34页 |
| 3.2.1 基因组DNA的去除 | 第33-34页 |
| 3.2.2 cDNA的合成 | 第34页 |
| 3.2.3 SlAtg1的克隆 | 第34页 |
| 3.3 SlAtg1的基因序列分析 | 第34-35页 |
| 3.4 SlAtg1表达质粒的构建 | 第35-36页 |
| 3.4.1 pET28a-Atg1-上600bp和pET28a-Atg1-下500bp的构建 | 第35页 |
| 3.4.2 SlAtg1的真核表达质粒的构建 | 第35-36页 |
| 3.5 SlAtg1的表达、蛋白纯化及抗体制备 | 第36-37页 |
| 3.5.1 Atg1上半段600bp以及下半段500bp的原核表达和纯化 | 第36-37页 |
| 3.5.2 SlAtg1小鼠及兔多克隆抗体的制备 | 第37页 |
| 3.6 脂质体转染细胞 | 第37页 |
| 3.7 免疫荧光检测SlAtg1在Sl-HP细胞中的定位 | 第37-38页 |
| 3.8 免疫荧光检测SlAtg1与Atg5、Atg6和Atg8在Sl-HP细胞中的共定位 | 第38页 |
| 3.9 SlAtg1干扰片段的克隆 | 第38-41页 |
| 3.9.1 SlAtg1基因RNA干扰片段选取 | 第38-40页 |
| 3.9.2 SlAtg1干扰片段的扩增 | 第40-41页 |
| 3.9.3 dsRNA的合成 | 第41页 |
| 3.10 氯化锂法提取质粒 | 第41页 |
| 3.11 实时荧光定量PCR反应 | 第41-43页 |
| 3.13 Western blot | 第43-44页 |
| 3.14 免疫共沉淀法 | 第44-45页 |
| 3.15 细胞自噬的诱导和抑制 | 第45-46页 |
| 第四部分 实验结果 | 第46-68页 |
| 4.1 SlAtg1基因分段保守区域扩增 | 第46页 |
| 4.2 SlAtg1基因保守区域扩增 | 第46-47页 |
| 4.3 SlAtg1生物信息学分析 | 第47-50页 |
| 4.3.1 SlAtg1系统进化树 | 第47-48页 |
| 4.3.2 SlAtg1保守区分析 | 第48-49页 |
| 4.3.3 SlAtg1蛋白的三级结构 | 第49-50页 |
| 4.4 目的基因SlAtg1蛋白的原核表达和多克隆鼠抗和兔抗的制备 | 第50-52页 |
| 4.5 SlAtg1蛋白在Sl-HP细胞中的定位 | 第52-53页 |
| 4.6 Atg1与Atg8、Atg6、Atg5在Sl-HP细胞中的共定位 | 第53-55页 |
| 4.7 Atg1-GFP与Atg1-Flag融合蛋白在Sl-HP中的表达 | 第55-56页 |
| 4.8 细胞自噬抑制剂处理对Sl-HP细胞外源Atg1含量的影响 | 第56页 |
| 4.9 饥饿处理对S1-HP细胞外源Atg1含量的影响 | 第56-57页 |
| 4.10 SlAtg1丰度的变化对细胞自噬的影响 | 第57-63页 |
| 4.10.1 SlAtg1超表达对细胞自噬的影响 | 第57-58页 |
| 4.10.2 斜纹夜蛾细胞SlAtg1干扰片段的扩增和dsRNA的合成 | 第58-59页 |
| 4.10.3 合成的SlAtg1-dsRNA干扰效果的检测 | 第59-60页 |
| 4.10.4 SlAtg1干扰48h后Atg1转录子的相对定量 | 第60-61页 |
| 4.10.5 SlATG1干扰对细胞自噬的影响 | 第61-63页 |
| 4.11 SlAtg1与Atg5相互作用的研究 | 第63-68页 |
| 4.11.1 SlAtg1与Atg5在TnH5细胞中的共定位 | 第63-65页 |
| 4.11.2 Co-IP技术探究Atg1与其他自噬相关蛋白的相互作用 | 第65-66页 |
| 4.11.3 Atg1与Atg5共表达对细胞自噬的影响 | 第66-68页 |
| 第五部分 讨论 | 第68-71页 |
| 5.1 SlAtg1在不同物种中具有不同的特性 | 第68页 |
| 5.2 自噬相关基因SlAtg1的功能研究 | 第68-70页 |
| 5.2.1 自噬诱导因子对SlAtg1基因表达的影响 | 第68-69页 |
| 5.2.2 SlAtg1在自噬体成熟过程中的作用 | 第69页 |
| 5.2.3 SlAtg1相互作用蛋白的鉴定 | 第69-70页 |
| 5.3 全文总结 | 第70-71页 |
| 本论文的创新之处 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-76页 |
| 硕士期间合作发表论文 | 第76-77页 |
| 致谢 | 第77页 |
