| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-8页 |
| 第一章 文献综述 | 第13-24页 |
| 1.miRNA研究进展 | 第13-18页 |
| 1.1 微小RNA | 第13-15页 |
| 1.2 循环miRNA | 第15-17页 |
| 1.3 miRNA检测技术 | 第17-18页 |
| 2.肺动脉高压研究进展 | 第18-24页 |
| 2.1 肺动脉高压 | 第18-19页 |
| 2.2 先天性心脏病合并肺动脉高压 | 第19-20页 |
| 2.3 肺动脉平滑肌细胞 | 第20页 |
| 2.4 PDGF-BB与肺动脉高压的发生和发展的关系 | 第20-21页 |
| 2.5 miR-328 的研究进展 | 第21-22页 |
| 2.6 PIM-1 基因的研究进展 | 第22-24页 |
| 第二章 一种灵敏特异的micro RNA荧光定量PCR检测方法 | 第24-49页 |
| 1. 材料与方法 | 第24-34页 |
| 1.1 实验材料 | 第24页 |
| 1.2 仪器 | 第24-25页 |
| 1.2.1 分子实验仪器 | 第24页 |
| 1.2.2 细胞培养相关仪器 | 第24-25页 |
| 1.2.3 其他仪器 | 第25页 |
| 1.3 实验方法-血清样本的收集 | 第25页 |
| 1.4 miRNA的检测 | 第25-31页 |
| 1.4.1 细胞总RNA提取方法 | 第25-26页 |
| 1.4.2 S-Poly(T)法检测细胞miRNA | 第26-27页 |
| 1.4.3 S-Poly(T) Plus法检测细胞miRNA | 第27页 |
| 1.4.4 血清总RNA的提取 | 第27-28页 |
| 1.4.5 第二次抽提血清总RNA | 第28页 |
| 1.4.6 不同浓度助沉剂提取血清总RNA | 第28-29页 |
| 1.4.7 S-Poly(T)法检测血清miRNA | 第29-30页 |
| 1.4.8 S-Poly(T) Plus法检测血清miRNA | 第30-31页 |
| 1.5 数据处理 | 第31页 |
| 1.6 本文检测的miRNA及引物序列 | 第31-34页 |
| 2. 实验结果及分析 | 第34-46页 |
| 2.1 S-Poly(T) Plus法检测miRNA | 第34-35页 |
| 2.2 S-Poly(T) Plus法和S-Poly(T)法检测细胞中miRNA的灵敏性比较 | 第35页 |
| 2.3 S-Poly(T) Plus法和S-Poly(T)法灵敏性比较 | 第35-36页 |
| 2.4 S-Poly(T)和S-Poly(T) Plus法检测细胞中miRNA的线性梯度范围 | 第36页 |
| 2.5 S-Poly(T) Plus法检测血清miRNA的线性梯度范围 | 第36-38页 |
| 2.6 不同加尾逆转录温度条件对S-Poly(T) Plus法的影响 | 第38-39页 |
| 2.7 miRNA是否加Poly（A）尾对S-Poly(T) Plus法的影响 | 第39-40页 |
| 2.8 不同浓度助沉剂对提取血清总RNA的影响 | 第40-41页 |
| 2.9 第二次血清RNA效果评价 | 第41-42页 |
| 2.10 几种不同RNA提取方法效率的比较 | 第42-43页 |
| 2.11 S-Poly(T) Plus应用于检测CHD-PAH病人血清miRNAs | 第43-44页 |
| 2.12 S-poly(T) Plus检测循环miRNA的完整实验流程 | 第44-46页 |
| 3. 讨论 | 第46-48页 |
| 3.1 S/P miRSOL法高效回收低丰度miRNA样品 | 第46页 |
| 3.2 S-Poly(T) Plus方法检测miRNA | 第46-48页 |
| 4. 结论 | 第48-49页 |
| 第三章 miR-328 在肺动脉平滑肌细胞异常增殖/迁移中的分子机制研究 | 第49-80页 |
| 1. 本文的研究目的、内容与意义 | 第49-51页 |
| 1.1 研究目的 | 第49页 |
| 1.2 研究内容 | 第49-50页 |
| 1.3 本文研究意义 | 第50-51页 |
| 2. 实验材料和方法 | 第51-65页 |
| 2.1 实验材料 | 第51页 |
| 2.2 实验方法 | 第51-64页 |
| 2.2.1 主要试剂的配置 | 第51-52页 |
| 2.2.2 miR-328 d Tu D载体的构建及慢病毒的包装和感染 | 第52-53页 |
| 2.2.3 PIM-1 的 3’-UTR荧光素酶载体及其突变载体的构建 | 第53页 |
| 2.2.4 细胞培养 | 第53-54页 |
| 2.2.5 sh PIM-1 载体的构建、慢病毒的包装和感染 | 第54-56页 |
| 2.2.6 双荧光素酶活性实验 | 第56页 |
| 2.2.7 细胞增殖实验 | 第56-57页 |
| 2.2.8 细胞迁移实验 | 第57-58页 |
| 2.2.9 补救实验 | 第58页 |
| 2.2.10 Real-time PCR | 第58-61页 |
| 2.2.10.1 总RNA提取 | 第58页 |
| 2.2.10.2 miRNA检测 | 第58-59页 |
| 2.2.10.3 m RNA检测 | 第59-61页 |
| 2.2.11 Western blots检测蛋白水平的变化 | 第61-64页 |
| 2.2.12 先天性心脏病合并肺动脉高压患者血清样本的收集 | 第64页 |
| 2.3 数据处理 | 第64-65页 |
| 3. 结果与分析 | 第65-75页 |
| 3.1 miR-328 在PDGF-BB诱导的PASMC中表达下调 | 第65-67页 |
| 3.2 miR-328 抑制PDGF-BB诱导的RPASMC的增殖 | 第67-68页 |
| 3.3 miR-328 抑制PDGF-BB诱导的RPASMC迁移 | 第68-69页 |
| 3.4 PIM-1 是miR-328 直接的靶基因 | 第69-71页 |
| 3.5 沉默PIM-1 抑制miR-328 下调对RPASMC增殖的促进作用 | 第71-72页 |
| 3.6 DNMT1与PDGF-BB诱导的miR-328 下调有关 | 第72-73页 |
| 3.7 miR-328 在先天性心脏病合并肺动脉高压患者血清/血浆中下调 | 第73-75页 |
| 4. 讨论 | 第75-79页 |
| 4.1 miR-328 与PAH | 第75-76页 |
| 4.2 PDGF-BB与肺动脉高压的发生和发展的关系 | 第76页 |
| 4.3 PASMC中PDGF-BB下调miR-328 的分子机制模型 | 第76-77页 |
| 4.4 miR-328 作为肺动脉高压血清/血浆生物标志物 | 第77-79页 |
| 5. 结论 | 第79-80页 |
| 参考文献 | 第80-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 攻读硕士学位期间的研究成果 | 第87页 |
