| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 缩略词 | 第13-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-21页 |
| 1.1 精子获能 | 第14-15页 |
| 1.2 顶体反应 | 第15-16页 |
| 1.3 精卵膜融合机制以及参与的重要蛋白分子 | 第16-20页 |
| 1.4 小结 | 第20-21页 |
| 第二章 研究论文 | 第21-65页 |
| 2.1 前言 | 第21-22页 |
| 2.2 实验材料与方法 | 第22-45页 |
| 2.2.1 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.2.1.1 主要试剂 | 第22页 |
| 2.2.1.2 主要仪器设备 | 第22页 |
| 2.2.1.3 常用溶液配制 | 第22-25页 |
| 2.2.1.4 实验菌株、动物和载体 | 第25页 |
| 2.2.2 实验方法 | 第25-45页 |
| 2.2.2.1 绵羊睾丸组织总RNA的提取 | 第25-26页 |
| 2.2.2.2 睾丸组织cDNA的合成和检测 | 第26-27页 |
| 2.2.2.2.1 睾丸组织cDNA的合成 | 第26-27页 |
| 2.2.2.2.2 cDNA产物的检测 | 第27页 |
| 2.2.2.3 绵羊Tssk6的cDNA全长的克隆 | 第27-29页 |
| 2.2.2.3.1 绵羊Tssk6引物的设计及合成 | 第27-28页 |
| 2.2.2.3.2 绵羊Tssk6的cDNA的扩增 | 第28页 |
| 2.2.2.3.3 Tssk6-T重组载体的构建与鉴定 | 第28-29页 |
| 2.2.2.3.4 Tssk6-T重组载体测序和生物信息学分析 | 第29页 |
| 2.2.2.4 构建pGEX-Tssk6、pGEX-Izumo1原核表达载体 | 第29-33页 |
| 2.2.2.4.1 Tssk6、Izumo1亚克隆引物的设计 | 第29-30页 |
| 2.2.2.4.2 Tssk6、Izumo1表达片段的扩增及过渡载体的构建 | 第30-31页 |
| 2.2.2.4.3 pGEX-Tssk6、pGEX-Izumo1载体构建 | 第31-33页 |
| 2.2.2.5 Tssk6和Izumo1的原核表达及鉴定 | 第33-34页 |
| 2.2.2.5.1 Tssk6和Izumo1的原核表达 | 第33页 |
| 2.2.2.5.2 TSSK6和IZUMO1蛋白的SDS-PAGE电泳和Western-blot检测 | 第33-34页 |
| 2.2.2.6 TSSK6-GST和IZUMO1-GST重组蛋白的纯化和抗体制备 | 第34-35页 |
| 2.2.2.6.1 蛋白质切胶纯化 | 第34页 |
| 2.2.2.6.2 Bradford法测定纯化后蛋白质浓度 | 第34-35页 |
| 2.2.2.6.3 动物免疫及血清抗体的制备 | 第35页 |
| 2.2.2.6.4 血清抗体的Western-blot检测 | 第35页 |
| 2.2.2.7 酵母双杂交实验 | 第35-38页 |
| 2.2.2.7.1 Tssk6和Izumo1酵母重组载体的引物设计 | 第35-36页 |
| 2.2.2.7.2 pGAD-Tssk6和pGBK-Izumo1载体构建与鉴定 | 第36页 |
| 2.2.2.7.3 LiAc法制备酵母感受态 | 第36-37页 |
| 2.2.2.7.4 重组载体转化酵母感受态细胞及鉴定 | 第37页 |
| 2.2.2.7.5 酵母双杂交验证 | 第37-38页 |
| 2.2.2.8 哺乳动物双杂交实验 | 第38-41页 |
| 2.2.2.8.1 Tssk6和Izumo1哺乳动物双杂交重组载体的引物设计 | 第38页 |
| 2.2.2.8.2 Izumo1和Tssk6重组片段的亚克隆及载体构建 | 第38-39页 |
| 2.2.2.8.3 人293T细胞的培养及共转染 | 第39-41页 |
| 2.2.2.8.3.1 人293T细胞培养 | 第39-40页 |
| 2.2.2.8.3.2 pFN-10A-Izumo1和pFN-11A-Tssk6载体共转染293T细胞 | 第40页 |
| 2.2.2.8.3.3 细胞转染步骤 | 第40-41页 |
| 2.2.2.8.4 哺乳动物双杂交结果检测 | 第41页 |
| 2.2.2.9 免疫共沉淀实验 | 第41-45页 |
| 2.2.2.9.1 免疫共沉淀真核表达载体的构建 | 第41-42页 |
| 2.2.2.9.1.1 Tssk6和Izumo1免疫共沉淀重组载体的引物设计 | 第41页 |
| 2.2.2.9.1.2 pCMV-Flag-Tssk6和pCMV-HA-Izumo1载体构建及鉴定 | 第41-42页 |
| 2.2.2.9.2 人293T细胞的共转染及总蛋白提取 | 第42-43页 |
| 2.2.2.9.2.1 人293T细胞培养 | 第42页 |
| 2.2.2.9.2.2 pCMV-Flag-Tssk6和pCMV-HA-Izumo1载体共转染 | 第42-43页 |
| 2.2.2.9.2.3 细胞总蛋白的提取 | 第43页 |
| 2.2.2.9.3 磁珠法免疫沉淀目标蛋白 | 第43页 |
| 2.2.2.9.4 SDS-PAGE凝胶电泳及Westem-blot检测 | 第43-45页 |
| 2.2.2.9.4.1 目标蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳 | 第43-44页 |
| 2.2.2.9.4.2 Westem-blot检测 | 第44-45页 |
| 2.3 实验结果与分析 | 第45-62页 |
| 2.3.1 绵羊Tssk6的cDNA全长的克隆 | 第45-53页 |
| 2.3.1.1 绵羊睾丸组织cDNA的质量检测 | 第45页 |
| 2.3.1.2 Tssk6的cDNA的克隆 | 第45-46页 |
| 2.3.1.3 重组载体Tssk6-T的双酶切鉴定 | 第46页 |
| 2.3.1.4 基因的测序结果与生物信息学分析 | 第46-53页 |
| 2.3.2 TSSK6和IZUMO1的原核表达及抗体制备 | 第53-56页 |
| 2.3.2.1 pGEX-Tssk6、pGEX-Izumo1原核表达载体的鉴定 | 第53页 |
| 2.3.2.2 TSSK6和IZUMO1的原核表达及鉴定 | 第53-55页 |
| 2.3.2.3 TSSK6-GST和IZUMO1-GST融合蛋白的纯化 | 第55-56页 |
| 2.3.2.4 TSSK6-GST和IZUMO1-GST动物血清抗体检测 | 第56页 |
| 2.3.3 酵母双杂交实验 | 第56-58页 |
| 2.3.3.1 pGAD-Tssk6和pGBK-Izumo1酵母重组载体的双酶切鉴定 | 第56-57页 |
| 2.3.3.2 重组载体转化酵母感受态细胞后PCR鉴定 | 第57页 |
| 2.3.3.3 酵母双杂交结果 | 第57-58页 |
| 2.3.4 哺乳动物双杂交实验 | 第58-60页 |
| 2.3.4.1 pFN-10A- Izumol和pFN-11A- Tssk6哺乳动物重组载体的双酶切鉴定 | 第58-59页 |
| 2.3.4.2 哺乳动物双杂交结果检测 | 第59-60页 |
| 2.3.5 TSSK6和IZUMO1免疫共沉淀 | 第60-62页 |
| 2.3.5.1 免疫共沉淀重组载体双酶切鉴定 | 第60页 |
| 2.3.5.2 免疫共沉淀结果分析 | 第60-62页 |
| 2.4 讨论 | 第62-64页 |
| 2.4.1 Tssk6的cDNA克隆及分析 | 第62页 |
| 2.4.2 TSSK6和IZUMO1的原核表达及抗体制备 | 第62页 |
| 2.4.3 TSSK6和IZUMO1相互作用的研究 | 第62-64页 |
| 2.5 本章小结 | 第64-65页 |
| 参考文献 | 第65-70页 |
| 致谢 | 第70-71页 |
| 攻读硕士期间参与的科研项目和发表的论文 | 第71页 |
