| 中文摘要 | 第4-7页 |
| Abstract | 第7-10页 |
| 缩略语/符号说明 | 第15-16页 |
| 前言 | 第16-20页 |
| 一、抗CD40高亲和力单链抗体克隆的筛选 | 第20-41页 |
| 1.1 对象和方法 | 第20-28页 |
| 1.1.1 实验技术路线图 | 第20页 |
| 1.1.2 菌株及文库 | 第20页 |
| 1.1.3 主要试剂 | 第20页 |
| 1.1.4 主要溶液配方 | 第20-21页 |
| 1.1.5 主要培养基配方 | 第21-22页 |
| 1.1.6 主要仪器 | 第22页 |
| 1.1.7 实验方法 | 第22-28页 |
| 1.2 结果 | 第28-35页 |
| 1.2.1 原始文库扩增后滴度测定 | 第28页 |
| 1.2.2 噬菌体展示个轮筛选筛选压力的测定 | 第28-29页 |
| 1.2.3 噬菌体展示各轮筛选克隆随机测序及相互比对 | 第29-30页 |
| 1.2.4 潜在阳性克隆的选择 | 第30-32页 |
| 1.2.5 噬菌体ELISA比较各克隆亲和力差异 | 第32页 |
| 1.2.6 第1次梯度噬菌体ELISA比较各克隆亲和力差异 | 第32-33页 |
| 1.2.7 第2次梯度噬菌体ELISA比较各克隆亲和力差异 | 第33-34页 |
| 1.2.8 8~ | 第34-35页 |
| 1.3 讨论 | 第35-40页 |
| 1.3.1 抗体筛选技术的选择 | 第36-37页 |
| 1.3.2 噬菌体展示系统的选择 | 第37-38页 |
| 1.3.3 噬菌体展示筛选策略的设计 | 第38-39页 |
| 1.3.4 潜在阳性克隆的选择 | 第39-40页 |
| 1.4 小结 | 第40-41页 |
| 二、抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及蛋白表达 | 第41-73页 |
| 2.1 对象和方法 | 第41-60页 |
| 2.1.1 实验技术路线图 | 第41页 |
| 2.1.2 菌株及文库 | 第41页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第41-42页 |
| 2.1.4 主要溶液配方 | 第42-43页 |
| 2.1.5 主要培养基配方 | 第43页 |
| 2.1.6 主要仪器 | 第43-44页 |
| 2.1.7 实验方法 | 第44-59页 |
| 2.1.8 统计学方法 | 第59-60页 |
| 2.2 结果 | 第60-68页 |
| 2.2.1 PCR扩增 8~ | 第60页 |
| 2.2.2 PCR扩增HER2 ScFv序列全长 | 第60-61页 |
| 2.2.3 重叠PCR拼接CD40×HER2 ScDb | 第61-62页 |
| 2.2.4 CD40×HER2 ScDb原核表达载体的构建及鉴定 | 第62页 |
| 2.2.5 CD40×HER2 ScDb基因测序及序列分析 | 第62页 |
| 2.2.6 CD40×HER2 ScDb基因序列翻译结果预测 | 第62-65页 |
| 2.2.7 CD40×HER2 ScDb蛋白理化性质分子结构预测 | 第65-66页 |
| 2.2.8 CD40×HER2 ScDb蛋白诱导表达及纯化 | 第66-67页 |
| 2.2.9 Western Blot检测目的蛋白His-tag表达 | 第67页 |
| 2.2.10 CD40×HER2 ScDb Ni-NTA琼脂糖蛋白纯化 | 第67-68页 |
| 2.2.11 BCA蛋白定量法测定CD40×HER2 ScDb蛋白浓度 | 第68页 |
| 2.3 讨论 | 第68-72页 |
| 2.3.1 双特异性单链抗体的构建 | 第69-70页 |
| 2.3.2 双特异性单链抗体蛋白表达体系的设计 | 第70-71页 |
| 2.3.3 重组蛋白原核表达产物的纯化 | 第71-72页 |
| 2.4 小结 | 第72-73页 |
| 三、抗CD40×HER2双特异性单链抗体免疫激活功能验证 | 第73-104页 |
| 3.1 对象和方法 | 第73-88页 |
| 3.1.1 实验技术路线图 | 第73页 |
| 3.1.2 实验动物及细胞 | 第73页 |
| 3.1.3 主要试剂 | 第73-74页 |
| 3.1.4 主要溶液及培养基配方 | 第74页 |
| 3.1.5 主要仪器 | 第74-75页 |
| 3.1.6 实验方法 | 第75-87页 |
| 3.1.7 统计学方法 | 第87-88页 |
| 3.2 结果 | 第88-98页 |
| 3.2.1 小鼠骨髓来源树突状细胞体外诱导及培养 | 第88页 |
| 3.2.2 流式细胞术检测不同干预组小鼠DC细胞表面标志物表达水平 | 第88-90页 |
| 3.2.3 ELISA检测不同组小鼠DC细胞上清IL-12 细胞因子水平 | 第90-91页 |
| 3.2.4 流式细胞术检测富集小鼠脾脏淋巴细胞CD3~+T淋巴细胞比例 | 第91-92页 |
| 3.2.5 ELISA检测不同组T细胞共培养后IFN-γ 表达水平的差异 | 第92-93页 |
| 3.2.6 肿瘤特异性T淋巴细胞对 4T1肿瘤细胞的杀伤 | 第93-94页 |
| 3.2.7 不同组 4T1小鼠肿瘤模型肿瘤生长趋势的比较 | 第94-96页 |
| 3.2.8 ELISA检测不同干预小鼠肿瘤组织中IFN-γ 细胞因子的表达水平 | 第96页 |
| 3.2.9 ELISA检测不同干预小鼠肿瘤组织中IL-12(p70)细胞因子的表达水平 | 第96-97页 |
| 3.2.10 HE染色检测不同组肿瘤组织中淋巴细胞浸润 | 第97-98页 |
| 3.2.11 IHC检测肿瘤细胞内Cleaved-caspase-3 的表达水平 | 第98页 |
| 3.3 讨论 | 第98-103页 |
| 3.3.1 CD40激动型抗体激活肿瘤免疫反应 | 第98-100页 |
| 3.3.2 CD40×HER2 ScDb促进小鼠树突状细胞成熟 | 第100-102页 |
| 3.3.3 CD40×HER2 ScDb诱导肿瘤特异性的免疫杀伤 | 第102-103页 |
| 3.4 小结 | 第103-104页 |
| 四、抗CD40×HER2双特异性单链抗体HER2靶向功能验证 | 第104-122页 |
| 4.1 对象和方法 | 第104-110页 |
| 4.1.1 实验技术路线图 | 第104页 |
| 4.1.2 动物及细胞系 | 第104页 |
| 4.1.3 主要试剂 | 第104页 |
| 4.1.4 主要溶液及培养基配方 | 第104-105页 |
| 4.1.5 主要仪器 | 第105页 |
| 4.1.6 实验方法 | 第105-109页 |
| 4.1.7 统计学方法 | 第109-110页 |
| 4.2 结果 | 第110-116页 |
| 4.2.1 细胞免疫荧光检测CD40×HER2 ScDb与HER2的靶向性 | 第110页 |
| 4.2.2 不同干预对T6-17 细胞增殖及形态的影响 | 第110-111页 |
| 4.2.3 CCK8检测不同干预对T6-17 细胞增殖的抑制率 | 第111-112页 |
| 4.2.4 WB检测不同组肿瘤细胞内PI3K/Akt信号通路相关分子的磷酸化水平 | 第112-113页 |
| 4.2.5 CD40×HER2 ScDb对裸鼠体内T6-17 肿瘤增殖的影响 | 第113-116页 |
| 4.2.6 HE染色检测不同干预对T6-17 肿瘤细胞形态的影响 | 第116页 |
| 4.3 讨论 | 第116-121页 |
| 4.3.1 针对HER2的分子靶向治疗 | 第116-117页 |
| 4.3.2 CD40×HER2 ScDb体外对T6-17 细胞增殖的抑制作用 | 第117-118页 |
| 4.3.3 CD40×HER2 ScDb对PI3K/Akt信号通路的抑制作用 | 第118-119页 |
| 4.3.4 CD40×HER2 ScDb对MAPK/ERK1/2 信号通路的抑制作用 | 第119-120页 |
| 4.3.5 CD40×HER2 ScDb抑制T6-17 细胞在小鼠体内的增殖 | 第120-121页 |
| 4.4 小结 | 第121-122页 |
| 全文结论 | 第122-124页 |
| 展望 | 第124-125页 |
| 论文创新点 | 第125-126页 |
| 参考文献 | 第126-140页 |
| 发表论文和参加科研情况说明 | 第140-141页 |
| 综述 抗体类药物在恶性肿瘤治疗中的应用 | 第141-157页 |
| 综述参考文献 | 第150-157页 |
| 致谢 | 第157-158页 |
| 个人简历 | 第158页 |
