| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-8页 |
| 第一章 综述 | 第12-26页 |
| 1.1 植物气孔发育的分子调控机制研究进展 | 第12-20页 |
| 1.1.1 气孔的发育模式 | 第12-14页 |
| 1.1.2 转录因子对气孔发育的调控 | 第14-16页 |
| 1.1.3 气孔发育过程中的细胞信号转导 | 第16-17页 |
| 1.1.4 调控气孔发育起始的分子机制 | 第17-18页 |
| 1.1.5 保卫细胞终末分化状态的维持 | 第18-20页 |
| 1.2 CRISPR/Cas9介导的基因组靶向编辑技术研究进展 | 第20-24页 |
| 1.2.1 基因组编辑技术 | 第20-22页 |
| 1.2.2 CRISPR/Cas9在植物基因功能研究中的应用 | 第22-24页 |
| 1.3 研究目的及意义 | 第24-25页 |
| 1.4 研究的主要内容 | 第25-26页 |
| 第二章 材料与方法 | 第26-46页 |
| 2.1 试验材料 | 第26-28页 |
| 2.1.1 植物材料及其处理方法 | 第26页 |
| 2.1.2 试剂、菌种和仪器 | 第26-28页 |
| 2.2 引物设计 | 第28-30页 |
| 2.3 基础分子实验操作 | 第30-32页 |
| 2.3.1 玉米及拟南芥基因组DNA的提取 | 第30页 |
| 2.3.2 玉米及拟南芥总RNA的提取 | 第30页 |
| 2.3.3 cDNA的获得 | 第30-31页 |
| 2.3.4 目的片段的PCR扩增 | 第31页 |
| 2.3.5 酶切反应 | 第31页 |
| 2.3.6 连接反应 | 第31页 |
| 2.3.7 重组质粒的大肠杆菌转化 | 第31-32页 |
| 2.3.8 电转感受态农杆菌制备 | 第32页 |
| 2.3.9 农杆菌电转化 | 第32页 |
| 2.4 CRISPR/Cas9载体构建 | 第32-35页 |
| 2.4.1 靶位点选择 | 第33页 |
| 2.4.2 靶点接头设计 | 第33页 |
| 2.4.3 sgRNA表达盒的构建 | 第33-35页 |
| 2.4.4 sgRNA表达盒插入pYLCRISPR/Cas9Pubi-B载体 | 第35页 |
| 2.4.5 连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞 | 第35页 |
| 2.5 蛋白亚细胞定位 | 第35-36页 |
| 2.5.1 溶液 | 第35-36页 |
| 2.5.2 侵染液制备 | 第36页 |
| 2.5.3 烟草培养及侵染叶片 | 第36页 |
| 2.5.4 激光共聚焦成像 | 第36页 |
| 2.6 拟南芥转基因 | 第36-38页 |
| 2.6.1 培养基及溶液 | 第36页 |
| 2.6.2 野生型拟南芥种植 | 第36-37页 |
| 2.6.3 侵染液的制备 | 第37页 |
| 2.6.4 花序(Floral-dip)法转化拟南芥: | 第37页 |
| 2.6.5 转基因拟南芥植株的筛选 | 第37页 |
| 2.6.6 转基因拟南芥植株的分子鉴定 | 第37-38页 |
| 2.7 玉米转基因 | 第38-40页 |
| 2.7.1 储备液及培养基 | 第38-39页 |
| 2.7.2 农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化 | 第39-40页 |
| 2.7.3 转基因玉米的分子鉴定 | 第40页 |
| 2.8 光合参数测定及光响应曲线的拟合 | 第40页 |
| 2.9 实时荧光定量PCR | 第40-41页 |
| 2.10 TBO染色 | 第41-42页 |
| 2.10.1. 试剂及储备液 | 第41页 |
| 2.10.2. 染色步骤 | 第41-42页 |
| 2.11 气孔扫描电镜观察 | 第42页 |
| 2.12 真核表达 | 第42-46页 |
| 2.12.1 酵母培养与表达所需培养基 | 第42-43页 |
| 2.12.2 酵母GS115感受态制备 | 第43页 |
| 2.12.3 重组质粒点转化毕赤酵母 | 第43页 |
| 2.12.4 多拷贝重组毕赤酵母的筛选 | 第43-44页 |
| 2.12.5 重组毕赤酵母诱导表达外源蛋白 | 第44-46页 |
| 第三章 结果与分析 | 第46-72页 |
| 3.1 ZmSTOMAGEN1基因在拟南芥中的功能 | 第46-50页 |
| 3.1.1 ZmSTOMAGEN1超表达载体的构建 | 第46-47页 |
| 3.1.2 超表达ZmSTOMAGEN1拟南芥植株的获得 | 第47-48页 |
| 3.1.3 超表达ZmSTOMAGEN1提高拟南芥的气孔指数/密度 | 第48-50页 |
| 3.2 ZmSTOMAGEN1亚细胞定位 | 第50-51页 |
| 3.3 CRISPR/Cas9靶向修饰玉米ZmSTOMAGEN-like基因 | 第51-59页 |
| 3.3.1 ZmSTOMAGEN-like基因靶位点的选择及CRISPR/Cas9载体的构建 | 第51-53页 |
| 3.3.2 CRISPR/Cas9系统转化玉米 | 第53-55页 |
| 3.3.3 转基因植株的分子鉴定 | 第55页 |
| 3.3.4 ZmSTOMAGEN-like基因编辑结果 | 第55-59页 |
| 3.4 STOMAGEN-like基因缺失对玉米气孔发育的影响 | 第59-65页 |
| 3.4.1 ZmSTOMAGEN-like基因缺失导致气孔指数/密度的减少 | 第59-61页 |
| 3.4.2 ZmSTOMAGEN-like基因缺失对气孔发育相关基因表达的影响 | 第61-62页 |
| 3.4.3 ZmSTOMAGEN-like基因的缺失对玉米气孔分布和形态结构的影响 | 第62-65页 |
| 3.5 ZmSTOMAGEN-like基因的缺失对玉米光合参数的影响 | 第65-67页 |
| 3.6 外源表达玉米STOMAGEN蛋白 | 第67-72页 |
| 3.6.1 外源表达载体的构建 | 第67-69页 |
| 3.6.2 外源蛋白的诱导表达及纯化 | 第69-72页 |
| 第四章 讨论 | 第72-76页 |
| 4.1 玉米中气孔发育相关基因的预测 | 第72-73页 |
| 4.2 ZmSTOMAGEN1基因正调控拟南芥气孔的发育 | 第73页 |
| 4.3 CRISPR/Cas9系统靶向修饰玉米ZmSTOMAGEN-like基因 | 第73-74页 |
| 4.4 ZmSTOMAGEN-like基因是玉米气孔发育的正调控因子 | 第74-75页 |
| 4.5 玉米气孔密度对光合作用的影响 | 第75-76页 |
| 第五章 结论与展望 | 第76-78页 |
| 5.1 结论 | 第76-77页 |
| 5.2 展望 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-84页 |
| 附录 | 第84-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第87页 |
