| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 符号说明 | 第11-13页 |
| 前言 | 第13-16页 |
| 第一部分 普氏立克次体主要蛋白抗原基因的克隆与表达 | 第16-29页 |
| 1 引言 | 第16页 |
| 2 材料 | 第16-22页 |
| ·菌株与质粒 | 第16-19页 |
| ·材料与试剂 | 第19页 |
| ·材料 | 第19页 |
| ·试剂 | 第19页 |
| ·仪器 | 第19-20页 |
| ·常用溶液的配制 | 第20-22页 |
| ·荧光定量PCR体系的配制(50μl) | 第20页 |
| ·PCR反应用2×Mix的配制(10ml) | 第20页 |
| ·10×电泳缓冲液(1L) | 第20页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶的配制(100ml) | 第20-21页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶的配制(10ml) | 第21页 |
| ·LB液体培养基的配制(1000ml) | 第21页 |
| ·2×SDS凝胶上样缓冲液的配制 | 第21页 |
| ·LB固体培养基的配制(1000ml) | 第21页 |
| ·TBST缓冲液(1L) | 第21页 |
| ·胶体蓝染色液(1L) | 第21-22页 |
| 3 方法 | 第22-25页 |
| ·普氏立克次体接种鸡胚卵黄囊膜繁殖立克次体 | 第22页 |
| ·普氏立克次体抗原基因的选择 | 第22-23页 |
| ·普氏立克次体基因组的提取及目的基因的扩增 | 第23页 |
| ·感受态细胞的制备 | 第23-24页 |
| ·重组质粒的构建 | 第24页 |
| ·重组质粒转化感受态细胞 | 第24页 |
| ·重组菌的诱导表达 | 第24页 |
| ·重组菌的表达鉴定 | 第24页 |
| ·重组质粒的测序鉴定 | 第24-25页 |
| ·重组菌株的冻存 | 第25页 |
| 4 结果 | 第25-27页 |
| ·普氏立克次体在鸡胚卵黄囊膜中繁殖 | 第25-26页 |
| ·目的基因的PCR扩增 | 第26页 |
| ·重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析[28] | 第26-27页 |
| 5 讨论 | 第27-29页 |
| 第二部分 普氏立克次体重组蛋白抗原的免疫印迹分析 | 第29-43页 |
| 1 引言 | 第29页 |
| 2 材料 | 第29-35页 |
| ·菌株、小鼠、感染血清 | 第29页 |
| ·试剂 | 第29-30页 |
| ·常用溶液的配制 | 第30-34页 |
| ·纯化普氏立克次体用磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(1L) | 第30页 |
| ·纯化普氏立克次体用蔗糖磷酸盐缓冲液(PBSS)的配制(1L) | 第30页 |
| ·27%蔗糖、7.6%的泛影葡胺的PBS液的配制 | 第30页 |
| ·荧光定量PCR体系的配制(50μl) | 第30-31页 |
| ·10×电泳缓冲液(1L) | 第31页 |
| ·免疫印迹转印缓冲液(1L) | 第31页 |
| ·TBST缓冲液(1L) | 第31页 |
| ·考马斯亮蓝染液(1L) | 第31页 |
| ·10×电泳缓冲液 | 第31页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳12%分离胶的配制(10ml) | 第31-32页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶的配制(10ml) | 第32页 |
| ·LB液体培养基的配制(1000ml) | 第32页 |
| ·LB固体培养基的配制(1000ml) | 第32页 |
| ·可溶性表达形式的目蛋白纯化所需缓冲液的配制 | 第32-33页 |
| ·包涵体表达形式目的蛋白纯化所需缓冲液的配制 | 第33页 |
| ·2×SDS上样缓冲液的配制 | 第33-34页 |
| ·磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(1L) | 第34页 |
| ·含0.1%Tween-20磷酸缓冲液(PBST)的配制(1L) | 第34页 |
| ·含1%BSA的封闭液的配制(100ml) | 第34页 |
| ·主要仪器 | 第34-35页 |
| 3 方法 | 第35-38页 |
| ·普氏立克次体的鸡胚大量培养及纯化 | 第35页 |
| ·实验感染BALB/c小鼠 | 第35-36页 |
| ·抗血清的制备 | 第36页 |
| ·重组菌蛋白表达形式的鉴定 | 第36页 |
| ·目的蛋白的纯化 | 第36-38页 |
| ·可溶性表达形式目的蛋白的纯化 | 第36-37页 |
| ·包涵体表达形式目的蛋白的纯化 | 第37-38页 |
| ·免疫印迹分析重组蛋白抗原 | 第38页 |
| 4 结果 | 第38-42页 |
| ·立克次体感染血清效价的测定 | 第38-39页 |
| ·重组菌种目的蛋白表达形式的鉴定 | 第39页 |
| ·重组目的蛋白的纯化 | 第39-40页 |
| ·免疫印迹分析重组蛋白抗原 | 第40-42页 |
| 5 讨论 | 第42-43页 |
| 第三部分 普氏立克次体重组蛋白抗原的蛋白芯片分析 | 第43-52页 |
| 1 引言 | 第43页 |
| 2. 材料与试剂 | 第43-44页 |
| ·材料 | 第43页 |
| ·试剂 | 第43页 |
| ·常用溶液的配制 | 第43-44页 |
| ·含0.05%Tween-20磷酸缓冲液(PBST)的配制(1L) | 第43-44页 |
| ·磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(1L) | 第44页 |
| ·含1%BSA的封闭液的配制(200ml) | 第44页 |
| ·含20%乙醇水溶液的配制(1L) | 第44页 |
| ·仪器 | 第44页 |
| 3 方法 | 第44-46页 |
| ·蛋白芯片的制备 | 第44页 |
| ·蛋白芯片的质控 | 第44-45页 |
| ·蛋白芯片与感染立克次体小鼠血清反应 | 第45-46页 |
| 4 结果 | 第46-51页 |
| ·蛋白芯片的制备与质量检测 | 第46-47页 |
| ·立克次体感染小鼠血清分析普氏立克次体蛋白芯片 | 第47-49页 |
| ·立克次体感染小鼠血清与普氏立克次体蛋白抗原芯片反应散点统计图 | 第49-51页 |
| ·结果 | 第51页 |
| 5 讨论 | 第51-52页 |
| 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-57页 |
| 综述 | 第57-62页 |
| 参考文献 | 第60-62页 |
| 攻读学位期间主要的研究成果目录 | 第62-63页 |
| 附件 | 第63-72页 |
| 致谢 | 第72页 |
