| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-13页 |
| 第一章 绪论 | 第13-20页 |
| ·研究背景 | 第13-14页 |
| ·聚乙烯醇简介与用途 | 第13页 |
| ·退浆中碱处理与酶处理工艺比较 | 第13-14页 |
| ·PVA 的生物降解 | 第14-18页 |
| ·降解 PVA 的微生物 | 第14-15页 |
| ·PVA 降解酶 | 第15-17页 |
| ·PVA 降解机制的研究 | 第17-18页 |
| ·立题依据和研究意义 | 第18-19页 |
| ·生物降解 PVA 的概况 | 第18页 |
| ·本课题的研究意义 | 第18-19页 |
| ·研究内容 | 第19-20页 |
| 第二章 Sphingopyxis sp. 113P3 聚乙烯醇脱氢酶基因的合成及在大肠杆菌中的融合表达与复性 | 第20-33页 |
| ·前言 | 第20页 |
| ·材料与方法 | 第20-25页 |
| ·菌株、质粒和培养基 | 第20-21页 |
| ·主要试剂 | 第21页 |
| ·主要仪器和设备 | 第21页 |
| ·PVADH 基因的密码子优化与合成 | 第21-22页 |
| ·PCR 扩增 mPVADH 基因 | 第22页 |
| ·分子克隆的相关操作 | 第22-23页 |
| ·构建质粒 pMD18-T/mPVADH | 第23页 |
| ·构建质粒 pET32a/mPVADH | 第23-24页 |
| ·重组酶的诱导表达 | 第24页 |
| ·重组酶的可溶表达优化 | 第24页 |
| ·SDS-PAGE 检测 | 第24页 |
| ·包涵体的复性与肠激酶切割 | 第24-25页 |
| ·PVADH 酶活检测 | 第25页 |
| ·蛋白浓度检测 | 第25页 |
| ·结果与讨论 | 第25-32页 |
| ·PVADH 密码子的优化、人工合成与信号肽分析 | 第25-27页 |
| ·构建表达质粒 pET32a/mPVADH | 第27-28页 |
| ·E. coli BL21 (DE3)/pET32a/mPVADH 在 25oC 的诱导表达 | 第28-29页 |
| ·E. coli BL21 (DE3)/pET32a/mPVADH 在 20oC 的诱导表达 | 第29-30页 |
| ·E. coli BL21 (DE3)/pET32a/mPVADH 在 20oC 添加葡萄糖的诱导表达 | 第30-31页 |
| ·包涵体的复性、肠激酶切割与 PVADH 酶活检测 | 第31-32页 |
| ·本章小结 | 第32-33页 |
| 第三章 成熟 Sphingopyxis sp. 113P3 PVADH 在毕赤酵母中表达、纯化与酶学性质研究 | 第33-48页 |
| ·前言 | 第33页 |
| ·材料与方法 | 第33-37页 |
| ·菌株、质粒和培养基 | 第33-34页 |
| ·主要试剂 | 第34页 |
| ·主要仪器和设备 | 第34页 |
| ·PCR 扩增 mPVADH 基因 | 第34页 |
| ·质粒和目的基因的限制性双酶切 | 第34-35页 |
| ·构建质粒 pPIC9K/mPVADH | 第35页 |
| ·质粒 pPIC9K/mPVADH 的线性化 | 第35页 |
| ·线性化质粒转化 P. pastoris GS115 | 第35页 |
| ·多拷贝转化子的筛选 | 第35页 |
| ·P. pastoris GS115/pPIC9K/mPVADH 的基因组 PCR 验证 | 第35-36页 |
| ·重组菌的摇瓶诱导表达 | 第36页 |
| ·重组菌在 3L 罐上的高密度发酵 | 第36页 |
| ·重组 PVADH 的 N-端氨基酸测序 | 第36页 |
| ·重组 PVADH 的纯化 | 第36页 |
| ·重组酶的酶学性质研究 | 第36-37页 |
| ·菌体干重测量方法 | 第37页 |
| ·重组 PVADH 酶活测定、SDS-PAGE、蛋白浓度检测 | 第37页 |
| ·重组酶三级结构模拟 | 第37页 |
| ·结果与讨论 | 第37-47页 |
| ·构建表达质粒 pPIC9K/mPVADH | 第37-39页 |
| ·重组质粒 pPIC9K/mPVADH 的线性化 | 第39页 |
| ·电转化与 G418 抗性筛选 | 第39-40页 |
| ·基因组 PCR 验证 mPVADH 基因 | 第40页 |
| ·P. pastoris/pPIC9K/mPVADH 的摇瓶诱导表达 | 第40-41页 |
| ·P. pastoris/pPIC9K/mPVADH 的高细胞密度发酵 | 第41-42页 |
| ·重组酶的 N-端氨基酸测序 | 第42-43页 |
| ·全长和截短 PVADH 的三维结构预测 | 第43-44页 |
| ·纯化重组酶 | 第44页 |
| ·重组酶的酶学性质 | 第44-47页 |
| ·本章小结 | 第47-48页 |
| 第四章 成熟 Sphingopyxis sp. 113P3 PVADH 在毕赤酵母中截短表达分析 | 第48-61页 |
| ·前言 | 第48-49页 |
| ·材料与方法 | 第49-52页 |
| ·菌株、质粒和培养基 | 第49页 |
| ·主要试剂 | 第49页 |
| ·主要仪器和设备 | 第49页 |
| ·本章所用的引物 | 第49-50页 |
| ·反转录 PCR | 第50-51页 |
| ·突变质粒的构建与转化 P. pastoris GS115 | 第51-52页 |
| ·重组菌的摇瓶诱导表达 | 第52页 |
| ·结果与讨论 | 第52-59页 |
| ·胞外蛋白酶对目的蛋白的降解 | 第52-53页 |
| ·RT-PCR 分析 mPVADH 基因的转录情况 | 第53-54页 |
| ·翻译错误导致 mPVADH 蛋白截短 | 第54-57页 |
| ·胞内蛋白酶错切导致 mPVADH 蛋白截短 | 第57-59页 |
| ·本章小结 | 第59-61页 |
| 第五章 截短 Sphingopyxis sp. 113P3 PVADH 在毕赤酵母中过量表达与相关机制分析 | 第61-73页 |
| ·前言 | 第61页 |
| ·材料与方法 | 第61-63页 |
| ·菌株、质粒和培养基 | 第61页 |
| ·主要试剂 | 第61页 |
| ·主要仪器和设备 | 第61页 |
| ·本章所用的引物 | 第61-62页 |
| ·质粒 pPIC9K/tPVADH 的构建、单酶切、电转化与 G418 抗性筛选 | 第62页 |
| ·重组菌的摇瓶诱导表达 | 第62页 |
| ·重组菌在 3L 罐的高密度发酵 | 第62页 |
| ·重组 PVADH 酶活力的测定、SDS-PAGE、蛋白浓度检测 | 第62页 |
| ·醇氧化酶活性检测 | 第62页 |
| ·细胞活力检测 | 第62页 |
| ·胞外蛋白酶活力检测 | 第62页 |
| ·半定量 PCR 和定量 PCR | 第62-63页 |
| ·比生长速率的计算 | 第63页 |
| ·结果与讨论 | 第63-71页 |
| ·质粒 pPIC9K/tPVADH 的构建、转化与 G418 抗性筛选 | 第63-64页 |
| ·P. pastoris/pPIC9K/tPVADH 的摇瓶诱导表达 | 第64-65页 |
| ·定量 PCR 分析 mPVADH 和 tPVADH 基因的转录水平 | 第65-66页 |
| ·诱导温度 28oC，不同甲醇浓度对产酶的影响 | 第66-67页 |
| ·诱导温度 22oC，不同甲醇浓度对产酶的影响 | 第67-69页 |
| ·诱导温度 28 和 22oC 最优诱导条件下细胞活力的比较 | 第69页 |
| ·诱导温度 28 和 22oC 最优诱导条件下胞外蛋白酶活力的比较 | 第69-70页 |
| ·诱导温度 28 和 22oC 最优诱导条件下 AOX 酶活和转录水平的比较 | 第70-71页 |
| ·本章小结 | 第71-73页 |
| 第六章 截短 PVADH 降解 PVA1799 的应用效果评价 | 第73-79页 |
| ·前言 | 第73页 |
| ·材料与方法 | 第73-74页 |
| ·质粒、菌株和培养基 | 第73页 |
| ·主要试剂 | 第73页 |
| ·主要仪器和设备 | 第73页 |
| ·氧化型 PVA 的制备 | 第73-74页 |
| ·凝胶过滤色谱检测物质分子量的条件 | 第74页 |
| ·PVA 粘度的计算 | 第74页 |
| ·结果与讨论 | 第74-78页 |
| ·红外光谱分析 PVA 1799 反应前后的变化 | 第74-75页 |
| ·核磁共振分析 PVA 1799 反应前后的变化 | 第75-76页 |
| ·凝胶过滤色谱检测 tPVADH 和 OPH 连续催化底物的分子量变化 | 第76-77页 |
| ·tPVADH 和 OPH 降解 PVA 过程的粘度变化 | 第77-78页 |
| ·本章小结 | 第78-79页 |
| 结论 | 第79-81页 |
| 主要创新点 | 第81-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-90页 |
| 附录 | 第90页 |
